葡萄籽提取物对破骨细胞分化的影响

目的检测葡萄籽提取物对破骨细胞分化、形成、功能的影响。方法利用实时定量基因扩增荧光检测系统(qPCR)检测破骨细胞分化标志分子的表达,利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及 TRAP活性定量实验检测破骨细胞的形成情况,利用c?TX定量实验检测破骨细胞的骨吸收活性。结果细胞克隆经诱导分化后,与对照组相比, GSE组细胞的破骨标志分子 Itgb3 mRNA相对表达量由(216.59±34.61)下降至(104.55±9.54)(n＝3,P＝0.0355); Acp5由(103.37±14.77)下降至(78.96±13.15)(n＝3,P＝0.0351); Dcst由(304.85±14.77)下降至(65.03±11.75)(n＝3,P＝0.0003); Ctsk由(290.23±41.65)下降(132.23±14.06)(n＝3,P＝0.0229)。经葡萄籽提取物处理后,破骨标志分子 Itgb3、Acp5、Dcst、Ctsk mRNA水平均显著降低, TRAP阳性细胞数目减少, TRAP活性由(2.52±0.39)下降至(0.91±0.10)(n＝3,P＝0.0165),TRAP活性显著降低;与对照组细胞相比, GSE组细胞分泌的 c?TX量由(1.01±0.11)nmol/L下降至(0.49±0.06)nmol/L(n＝3,P＝0.0028),c?TX分泌显著减少。结论葡萄籽提取物有效抑制破骨细胞分化、形成及活性,葡萄籽提取物是潜在的预防治疗骨质疏松的营养补充剂。     

基质Gla蛋白对骨量的调节作用及其机制

目的 检测基质Gla蛋白（MGP）对小鼠骨量的影响,分析其作用机制。 方法 利用腺相关病毒干涉小鼠体内MGP基因表达,microCT扫描分析检测小鼠骨量,利用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测小鼠股骨破骨细胞的数目,利用ELISA检测骨转换标志物TRAP5b水平。 结果 与对照组相比,经过MGP干扰处理的小鼠骨体积分数显著降低,骨小梁数目和骨小梁厚度也显著减少,骨小梁间隔显著增高,差异均有统计学意义（均P<0.01）。小鼠股骨切片TRAP阳性破骨细胞数目增多,血清TRAP5b水平显著增加（P<0.01）。 结论 MGP可能通过抑制破骨细胞形成和骨吸收来维持骨量。     

CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响

目的利用 CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质 Gla蛋白(MGP)基因敲除的 RAW264.7巨噬细胞系,明确 MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出 3个针对 MGP基因外显子区的单链向导 RNA(gRNA)人工合成 gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的 LentiCRISPRv2质粒中,构建成 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA重组质粒。将重组,质粒与 psPAX2、VSVG包装质粒一同转染 293?T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染 RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定 RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证 MGP mRNA及蛋白表达水平。 qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA重组质粒,成功包装了含有 MGP?gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达 MGP的 RAW264.7细胞系。 qPCR及蛋白质印迹法检测显示,MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P＜0.05)。 qPCR结果显示,最具有代表性的 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA1细胞破骨标志分其子 Itgb3(2.29±0.17)、 Acp5(2.86±0.15)、 Ctsk(2.07±0.13)的 mRNA水平均显著上调(P＜0.05)。结论利用 CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了 MGP基因敲除的 RAW264.7细胞系,敲除 MGP后 RAW264.7细胞破骨分化能力增强。