饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸对肺癌细胞增殖与自噬的影响

目的 研究饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸对肺癌细胞增殖与自噬的影响.方法 用0、30、60、120、240μmol/L硬脂酸(饱和脂肪酸)和DHA(不饱和脂肪酸)分别处理肺癌细胞A549,绘制细胞生长曲线并计算克隆形成率以检测细胞增殖.采用硬脂酸和DHA分别处理A549细胞24h后,采用激光共聚焦显微镜从形态学方面观察细胞自噬情况.采用硬脂酸和DHA分别处理A549细胞12、24、36h后,用Western blotting检测细胞自噬相关蛋白的表达.结果 30~240μmol/L硬脂酸和DHA均有抑制A549细胞增殖的作用(P<0.05),硬脂酸、DHA处理A549细胞24h后均检测到细胞出现明显的自噬;Western blotting结果 显示,硬脂酸、DHA分别处理A549细胞12、24、36h后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(ser2481)磷酸化水平降低(P<0.05).结论 饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸均有抑制肺癌细胞增殖、诱导肺癌细胞自噬的作用,其机制可能与p-mTOR(ser2481)信号通路有关.     

CT评估的脂肪肝与高脂血症性急性胰腺炎严重程度的相关性

目的：探讨CT评估的脂肪肝与高脂血症性急性胰腺炎（HLAP）病情严重程度的相关性。方法：回顾性分析223例HLAP患者资料,根据肝/脾CT值将患者分为无、轻度脂肪肝组及中重度脂肪肝组。采用单因素和多因素logistic回归分析影响HLAP严重程度的独立危险因素。结果：有184例（82.5%）HLAP患者合并脂肪肝。与无、轻度脂肪肝患者相比,中重度脂肪肝患者住院时间超过2周的比率增高（55.7% vs. 39.3%,P ＜0.05）。中重度HLAP组患者的平均血甘油三酯（TG）水平高于轻度HLAP组（P ＜0.01）,而肝/脾CT值比低于HLAP组（P ＜0.01）。单因素logistic回归分析显示,合并中重度脂肪肝及TG水平高是中重度HLAP的危险因素（均P ＜0.05）。经多因素logistic回归分析校正后,合并中重度脂肪肝仍是中重度HLAP的独立危险因素（P ＜0.05）。此外,合并中重度脂肪肝HLAP患者经治疗后,67.0%转为无或轻度脂肪肝。结论：基于CT平扫评估的脂肪肝严重程度与HLAP患者严重程度和住院时间有关。     

含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。     

湛江市硇洲马尾藻多肽的制备及活性探讨

摘要：目的 从马尾藻中提取活性多肽,并研究其在抗菌和抑制血栓形成方面的活性。 方法sephdexG-50凝胶层析柱和高效液相色谱柱分离纯化多肽组份,以280nm监测样品;Molish实验检测提取的多肽含糖量;用比浊法检测不同剂量的马尾藻多肽（0、10、20、40、60、80 μg/mL）对大肠埃希菌（D1314）和金黄色葡萄球菌（s.agr+ 、RN4220）生长的影响;将大鼠随机分为生理盐水组、马尾藻多肽（100、200、400μg/mL）、肝素1600U/mL组,分别给予相应药物,电刺激大鼠颈动脉形成血栓,观察大鼠颈动脉血栓形成的情况。 结果 可从马尾藻匀浆上清液中获得2个收集峰,主要多肽集中在B收集峰;高效液相分析分析B收集峰由6个组份组成;Molish实验显示多肽组份不含多糖类物质;比浊法显示多肽组份具有抑制大肠埃希菌的生长,而对金黄色葡萄球菌不敏感;且通过电刺激大鼠颈动脉血栓形成,发现该多肽具有抑制血栓形成的作用。 结论 我们成功从马尾藻中提取活性多肽组份,该多肽组份具有抑制大肠埃希菌生长和血栓形成的作用。     

蟾毒灵抑制胆总管癌细胞QBC-939增殖和诱导凋亡的实验研究

目的观察蟾毒灵对人胆管癌细胞QBC-939增殖和凋亡的影响,以及凋亡相关蛋白表达量的变化。方法体外培养人胆管癌QBC-939细胞,运用MTT检测蟾毒灵对胆管癌细胞增殖的影响,采用流式细胞仪检测蟾毒灵对胆管癌细胞凋亡率和线粒体膜电位的影响;并采用Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase3、激活型的Caspase3(Cleaved-Caspase3)和Cleaved-PARP的表达量变化。结果蟾毒灵对人胆管癌细胞QBC-939增殖具有明显抑制作用,在一定浓度下表现出时间、剂量依赖性。流式细胞仪检测显示:细胞的凋亡率明显增加;线粒体膜电位随蟾毒灵浓度增加,膜电位发生下调。Western blotting结果显示:蟾毒灵处理QBC-939细胞48h后,Caspase3蛋白被剪接活化,激活型的Caspase3(Cleaved-Caspase3)表达量升高;同时,Caspase3的作用底物多聚聚合酶PARP的降解产物(Cleaved-PARP)表达明显升高,且呈浓度依赖性。结论蟾毒灵能够明显抑制人胆管癌QBC-939细胞的增殖,并呈时间和浓度依赖性;线粒体凋亡途径在蟾毒灵的抗癌过程中发挥了作用。     

干细胞来源外泌体对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的研究大鼠脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exosomes,Exo)对肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)的保护作用。方法胶原酶法提取SD大鼠原代脂肪间充质干细胞,超速离心法提取干细胞来源的外泌体。SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、缺血再灌注损伤组(IR)、缺血再灌注损伤外泌体治疗组(IR+Exo)。Sham组腹部正中切口,离断肝脏周围韧带,不做其他处理;IR组用动脉夹阻断70%肝脏血流60 min;IR+Exo组70%肝脏血流阻断60 min后,尾静脉注射外泌体观察其对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)含量。检测肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)含量。Western blotting法检测氧化应激指标醌氧化还原酶(NQO-1)、血红素氧合酶1(HO-1),凋亡相关指标Bcl-2、Bax,HE染色观察肝组织病理变化。结果相比IR组,IR+Exo组血清中ALT、AST、TNF-α、IL-1β水平显著下降(P0.05),SOD活性显著升高(P0.05),MDA含量明显下降(P0.05)。NQO1、HO-1、Bcl-2表达量显著升高,Bax显著下降(P0.05),肝组织病理损伤明显改善。结论外泌体能够减轻肝脏缺血再灌注损伤,其可能通过缓解氧化应激、抑制炎症反应、抗凋亡而发挥作用。     

CRISPR/Cas9系统构建ROCK2基因敲除肺癌细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9编辑系统对人肺癌细胞系A549、H460细胞中Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)基因进行稳定敲除,并对其敲除效果进行验证。初步探讨ROCK2基因敲除肺癌细胞株的细胞水平上的功能改变。方法 利用Rock-2 CRISPR 质粒和Rock-2 HDR 质粒转染构建A549、H460 ROCK2基因敲除稳定细胞株。蛋白质印迹法验证敲除效果、用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ROCK2基因的mRNA表达水平。平板克隆形成实验、MTT法检测各细胞株的增殖能力。结果 A549、H460肺癌细胞中ROCK2基因稳定敲除株构建成功。与原始细胞株相比,ROCK2敲除株细胞中的蛋白表达水平完全缺失,细胞内的mRNA表达水平显著下降,而且能降低A549、H460肺癌细胞的增殖能力。结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得ROCK2基因敲除的肺癌细胞系,为进一步研究ROCK2对肺癌生长的影响奠定基础。     

一种新型大鼠胰腺去细胞化支架的制备研究

目的通过经胃左动脉途径灌注,选择胰腺体尾部作为灌注主体,应用各种去细胞化灌注技术,以制备新型天然胰腺去细胞化生物支架,并全面评价其理化特性,以期为胰腺组织再生工程的研究提供良好的应用载体。方法选择健康成年雄性SD大鼠,离体获取胰体尾部作为灌注主体,采用胃左动脉作为灌注入路,通过物理冻融、酶解法及曲亚通(TritonX-100)为主辅以十二烷基硫酸钠(SDS)的洗脱剂组合进行顺行灌注,获取胰腺去细胞支架。并通过大体形态观察、美兰染色、组织病理学观察、基因组DNA定量分析、电镜观察、胶原蛋白成分鉴定、免疫原性分析等对去细胞化后的胰腺支架进行全面的评价。结果本研究方法可成功制备肉眼透明的胰腺去细胞化支架,组织学检测和电镜观察均表明去细胞支架内无细胞残留,内部脉管网络和空间结构保存完整;免疫荧光分析表明去细胞化后支架的细胞外基质成分保留得较为完整,且支架DNA残留量为(42.3±10.6)ng/mg,不足正常胰腺的5%;皮下移植实验证实获得的去细胞化支架具有良好的组织相容性。结论以胰腺体尾部作为灌注主体,经胃左动脉途径灌注的策略能够成功制备一种新型的去细胞化胰腺支架,并且支架的基质成分和理化特性较完整地保留,能够为胰腺组织工程研究提供一种良好的载体选择。