樟芝多糖通过调节肠黏膜浸润的Th9及IL-9的表达调控小鼠慢性结肠炎的机制研究

目的 研究樟芝多糖调节结肠黏膜浸润的Th9及其细胞因子IL-9的表达,从而减轻小鼠慢性结肠炎的机制。方法 利用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）构建小鼠慢性结肠炎模型,设置正常组、模型组、阳性对照组（抗IL-9抗体注射组）以及樟芝多糖组（20 mg·kg^-1）。DAI评分综合评价小鼠1个月内活动能力,测定小鼠1个月内的体质量变化,流式细胞术检测外周血、结肠黏膜固有层中单个核细胞中CD4+IL-9+T细胞的比例,ELISA法检测外周血及结肠黏膜中IL-9、TGF-β以及IL-4的表达,实时荧光定量PCR检测小鼠结肠黏膜中IL-9、TGF-β、smad3及IL-4的表达,HE染色观察小鼠结肠组织病理。结果 DSS可以引起小鼠慢性结肠炎性病变,DAI评分结果显示模型组小鼠活动能力明显下降,而樟芝多糖干预后DAI评分显著降低（P<0.05）,模型组小鼠外周血及结肠黏膜固有层中Th9比例相比正常组显著增高（P<0.05）,外周血及结肠黏膜中IL-9、TGF-β及IL-4的蛋白及mRNA表达也显著增高（P<0.05）。阳性对照组及樟芝多糖组小鼠外周血及结肠黏膜固有层中Th9比例相比模型组显著下调（P<0.05）,且外周血及结肠黏膜中IL-9,TGF-β以及IL-4的蛋白及mRNA表达也显著下调（P<0.05）,HE染色结肠病理情况明显好转。结论 樟芝多糖可以通过调节Th9比例和IL-9表达改善小鼠慢性结肠炎,其作用与免疫调节及抗炎作用有关。     

樟芝多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用

目的探究樟芝多糖对于环磷酰胺构建的免疫抑制小鼠模型的免疫功能的调节作用。方法利用水提醇沉原理提取得到3种樟芝多糖,环磷酰胺构建免疫抑制小鼠模型。应用3种樟芝多糖进行干预,分别检测细胞免疫和体液免疫的相关指标,包括胸腺指数、脾脏指数、T淋巴细胞亚群、淋巴细胞增殖活性、自然杀伤(NK)细胞杀伤能力以及血清中白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)、IgG、IgM的表达。结果环磷酰胺构建的免疫抑制小鼠的免疫功能得到全面抑制,而3种樟芝多糖可以不同程度的提高免疫抑制小鼠的免疫功能,且相同剂量下,90%乙醇沉淀得到的多糖效果优于其他两种(P0.05)。结论樟芝多糖可以提高免疫抑制小鼠的免疫能力,且90%乙醇沉淀的多糖效果更优。     

HPGPC联合HPLC-ELSD测定樟芝子实体中多糖分子量、多糖组成和单糖含量

目的:建立高效凝胶色谱法(HPGPC)测定樟芝子实体中多糖分子量,HPLC-ELSD法测定樟芝子实体多糖组成和单糖含量的分析方法。方法:HPGPC法采用ShodexOHPak SB-803HQ色谱柱(300 mm×8 mm);流动相:0.70%硫酸钠溶液(含0.02%的叠氮钠);柱温:35℃,流速:0.5 mL/min。HPLC-ELSD法采用Zorbax Carbohydrate色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-水(80∶20);柱温:30℃;流速:0.5 mL/min。联合上述两种方法进行测定。结果:采用上述HPGPC法可以成功计算出樟芝子实体多糖的分子量,采用HPLC-ELSD法可以测定樟芝多糖的组成及单糖的含量。结论:HPGPC联合HPLC-ELSD法可以简单快速的测定樟芝子实体多糖的分子量、多糖的组成和单糖的含量,可以用于樟芝子实体多糖提取纯化后的质量控制。     

丁苯酞对神经干细胞向神经细胞分化的促进作用

目的 研究丁苯酞通过PI3K-AKT信号通路促进神经干细胞向神经细胞分化的作用。方法 分离培养SD大鼠胚胎脑皮质层的神经干细胞,采用分化专用完全培养基培养后,通过光镜下观察和Nestin蛋白免疫荧光法进行鉴定。设置对照组和实验组,其中实验组添加丁苯酞辅助分化,分为丁苯酞低剂量组（1 μmol·L^-1）、中剂量组（5 μmol·L^-1）和高剂量组（10 μmol·L^-1）,作用24 h后,CCK-8法检测神经干细胞的细胞活力,碱性磷酸酶染色法检测神经干细胞的分化能力,免疫荧光法检测神经细胞分化程度,RT-qPCR法检测转录因子SOX2、PAX6和NeuN的mRNA表达水平,Western-blot及RT-qPCR检测PI3K-AKT信号通路的表达。结果 丁苯酞干预后神经干细胞活力提高,分化能力提高,碱性磷酸酶试验呈强阳性,转录因子SOX2、PAX6和NeuN的mRNA表达水平增高,PI3K-AKT信号通路蛋白和mRNA表达水平均增高,且呈现剂量依赖性。结论 丁苯酞可以促进神经干细胞向神经细胞分化,其作用机制可能与PI3K-AKT的激活有关。     

羟氯喹逆转慢性髓性白血病细胞K562/IMA对伊马替尼耐药的作用机制研究

目的探讨羟氯喹逆转慢性髓性白血病细胞K562/IMA对伊马替尼（IMA）耐药的作用机制。方法体外培养人慢性髓性白血病细胞K562/IMA（对10滋mol/L的IMA耐药）,将细胞分为对照组（Con组）、IMA干预组（IMA组）、羟氯喹+IMA干预组（HCQ+IMA组）,并在含相关药物的培养基中继续培养。采用CCK-8法检测细胞增殖率的变化,AnnexinV-FITC/PI染色后流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,免疫荧光法染色检测细胞自噬激活标志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ的表达,MDC染色检测细胞自噬酸性囊泡的产生,Westernblot法检测细胞自噬相关蛋白p62、Beclin-1及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达。结果IMA组细胞增殖率明显高于HCQ+IMA组（P＜0.05）,细胞凋亡率明显低于HCQ+IMA组（P＜0.05）。HCQ+IMA组细胞侵袭能力明显低于IMA组（P＜0.05）。HCQ+IMA组细胞LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达下调,酸性囊泡形成水平降低,与IMA组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。HCQ+IMA组细胞p62蛋白表达水平高于IMA组（P＜0.05）,而Beclin-1蛋白表达水平低于IMA组（P＜0.05）,同时凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达水平高于IMA组（均P＜0.05）,抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达水平低于IMA组（P＜0.05）。结论羟氯喹可以逆转IMA耐药CMLK562细胞对IMA的敏感性,其作用机制或与抑制细胞自噬有关。     

TPI教学模式在临床本科大课中的应用探究

目的探讨TPI(理论-实践-互动式教学方法)在临床医学教学中的应用。方法对承德医学院2013及2014级临床医学专业4个大班(n=544)第4学年第2学期疼痛诊疗学课程的教学进行研究,抽签分组,2013级临床医学专业1大班及2014级临床医学专业2大班(A组,n=273)采用TPI教学法,2013级临床医学专业2大班及2014级临床医学专业1大班(B组,n=271)采用传统理论教学法(LBL),学期末,对于两个班同学的期末成绩以及对课程的评价进行统计学分析。结果经统计学分析,TPI教学法与传统教学法相比较,能够提高课堂活跃度(P0.05),增强课后记忆度(P0.05),提高学生自身解决问题能力(P0.05)。经统计学分析,TPI教学法与传统教学法相比较,在教学设计、教学内容、教学方法、情感教育、教学基本功、教学效果、教学特色、考试模式等方面比较(P0.05),差异具有统计学意义。经统计学分析,对于两组同学的综合学习成绩进行比较,A组综合学习成绩明显优于B组,比较结果具有统计学意义(P0.05)。结论 TPI教学法,充分发挥了教师知识传播作用与学生互动作用,取得良好教学效果,适合在我国高校医学临床大课授课中推广使用。     

来那度胺抑制小鼠Lewis瘤作用机制的研究

目的通过观察来那度胺对Lewis荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群/树突状细胞比例和程序性死亡受体1及其配体（PD1/PD-L1）通路的影响,探讨来那度胺经免疫途径治疗实体瘤的作用机制。方法细胞实验中,采用CCK8法和Hoechst33258染色检测来那度胺对细胞凋亡的影响。动物实验中将小鼠设置为对照组、模型组、低剂量组和高剂量组4组,每组10只,对照组为正常小鼠,模型组、低剂量组、高剂量组为移植Lewis肺癌细胞的荷瘤小鼠,低剂量组采用1mg/kg来那度胺、高剂量组采用10mg/kg来那度胺灌胃,连续14d后处死小鼠,取肿瘤组织并称重。流式细胞术测定肿瘤浸润组织和外周血中T淋巴细胞亚群/树突状细胞比例。Westernblot法测定PD1、PD-L1蛋白表达水平。结果来那度胺对Lewis肺癌细胞株无明显细胞毒性,但在小鼠体内可以抑制肿瘤的生长,增加肿瘤浸润组织和外周血中T淋巴细胞亚群/树突状细胞比例,且高剂量组效果优于低剂量组（均P＜0.05）。来那度胺还可以降低肿瘤组织中PD1、PD-L1蛋白表达水平。结论来那度胺对Lewis肺癌细胞株无细胞毒性,抗肿瘤作用与提高体内免疫功能,减小免疫抑制有关。     

樟芝多糖通过ROS-NOX2-NLRP1信号减轻皮层神经细胞炎症损伤的作用研究

目的探讨樟芝多糖（ACP）通过抑制活性氧（ROS）-NADPH氧化酶2（NOX2）-NLRP1信号减轻皮层神经细胞（CNC）炎症损伤的作用和机制。方法在研究ACP抗炎症反应作用的实验中,将CNC分为对照组、脂多糖（LPS）组、ACP5mg/L组、ACP10mg/L组和ACP20mg/L组。对照组为常规培养的细胞,无LPS和ACP干预;LPS组用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应;ACP各组分别使用终浓度为5、10、20mg/L的ACP进行预处理6h后,再用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应。在研究ACP通过抑制ROS发挥作用的机制研究中,将CNC分为LPS组、N-乙酰半胱氨酸（NAC）组和NAC+ACP组。LPS组用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应;NAC组用10mMNAC预处理4h后,再用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应;NAC+ACP组同时用10mMNAC和20mg/LACP预处理4h后,再用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应。采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,探针检测ROS的表达,Westernblot法检测NOX2、NLRP1蛋白表达水平,ELISA法检测培养基中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平。结果ACP预处理后,与LPS组比较,ACP5mg/L组、ACP10mg/L组和ACP20mg/L组细胞活力均明显上调,细胞凋亡率均下调,细胞中ROS的荧光光度值均降低,NOX2和NLRP1蛋白表达水平均降低,IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低（均P＜0.05）。ROS抑制剂NAC预处理后,与LPS组比较,NAC组和NAC+ACP组细胞凋亡率均下调,细胞中ROS的荧光光度值均降低,NOX2和NLRP1蛋白表达水平均降低,IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均降低（均P＜0.05）;而NAC组和NAC+ACP组细胞凋亡率、细胞中ROS的荧光光度值、NOX2和NLRP1蛋白表达水平及L-1β、IL-6和TNF-α表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论ACP可以通过抑制ROS的表达来抑制NOX2-NLRP1的激活,从而减轻CNC的炎症反应。     

断痫方颗粒剂对慢性癫痫小鼠的干预作用及P450酶系统的影响

目的:研究断痫方颗粒剂对于慢性癫痫小鼠的行为学、海马体谷氨酸阳性细胞的干预作用及肝脏P450酶的影响。方法:戊四氮构建慢性癫痫小鼠模型,设置正常对照组、模型组和断痫方颗粒剂高、低剂量组。记录各组实验期间的发作次数、全身强直痉挛发作时间、Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力,免疫组化法检测小鼠海马体谷氨酸阳性细胞的表达,q PCR法检测小鼠肝脏P450酶系的表达,Elisa法检测脑组织中MDA、GSH-Px水平。结果:与模型组比较,断痫方颗粒剂各组癫痫发作的次数显著减少(P0.05或P0.01),Morris迷宫实验结果显示断痫方颗粒剂各组在Morris水迷宫实验的表现优于模型组(P0.01)。免疫组化结果显示断痫方颗粒各组谷氨酸阳性细胞表达明显低于模型组。Elisa结果显示断痫方颗粒剂各组脑组织MDA表达显著降低,GSH-Px表达显著升高(P0.05或P0.01),断痫方颗粒剂高剂量组肝脏CYP1A2、CYP2E1、CYP2CⅡ、CYP3A1酶表达显著降低(P0.05或P0.01)。结论:断痫方颗粒剂对慢性癫痫小鼠有着很好的治疗作用,高剂量下会抑制肝脏P450酶表达,临床应用中应注意剂量的调整。     

晚期胃癌患者肿瘤组织及外周血中肺耐药相关蛋白mRNA的表达与DCF化疗方案的疗效及预后的关系

目的探讨晚期胃癌患者肿瘤组织及外周血中肺耐药相关蛋白(LRP)m RNA的表达水平对接受DCF化疗方案(多西他赛+顺铂+氟尿嘧啶)的疗效及预后的预测作用,为临床晚期胃癌的治疗提供参考。方法收集嘉兴市第二医院2015年1月至2017年6月收治的58例晚期胃癌患者为研究对象。所有患者均接受DCF化疗方案姑息治疗。采用实时荧光定量PCR法(RT-QPCR)法对患者胃癌组织和外周血中LRP m RNA的表达进行检测。以外周血和肿瘤组织中LRP m RNA表达的中位数(分别为0.45和0.50)为界,分为高表达和低表达两组,比较患者的化疗缓解率、肿瘤进展时间(TPP)、中位总生存时间(OS)。采用SPSS 17.0软件包进行秩和检验、χ~2检验,预后影响因素采用Cox回归进行分析。结果肿瘤组织中LRP m RNA低表达患者的TPP和OS(中位数分别为7.8和12.7月)显著高于高表达患者(中位数分别为6.2和10.1月);外周血中LRP m RNA低表达患者TPP和OS(中位数分别为7.6和13.4月)显著高于高表达患者(中位数分别为6.4和10.8月);肿瘤组织及外周血共同低表达的患者TPP和OS(中位数分别为8.0和13.8月)显著高于高表达患者(分别为6.0和9.7月),差异均有统计学意义(P0.01)。Cox回归分析结果显示,肿瘤组织或外周血中LRP m RNA高表达(HR=2.44,95%CI:1.22~4.70;HR=2.40,95%CI:1.10~4.58)及肿瘤组织和外周血中LRP m RNA共同高表达(HR=1.62,95%CI:1.38~4.83)是影响OS的独立不良预后因素。结论 LRP m RNA的高表达可能与DCF化疗的耐药相关,LRP m RNA的检测可以作为化疗效果及预后的预测指标之一,有助于晚期胃癌患者的化疗个体化治疗。