血瘀证患者血浆组织型纤溶酶原激活因子与组织型纤溶酶原激活抑制因子活性改变的观察

探讨急性心肌梗塞、冠心病及恶性肿瘤等血瘀证的准确治则。观察１２４例血瘀证患者，与２８例正常中老年作对照，以分析血浆组织型纤溶酶原激活因子（ｔＰＡ）和组织型纤溶酶原激活抑制因子（ＰＡＩ）的活性改变与临床病证的关系。结果：冠心病组（７９例）与对照组比较，血浆ｔＰＡ活性显著降低，ＰＡＩ活性显著升高（Ｐ均＜０．０５）；急性心肌梗塞组（１５例）与对照组比较，血浆ｔＰＡ活性高于其１．５倍，而ＰＡＩ活性也明显增高（Ｐ均＜０．０５）；恶性肿瘤组（３０例）血浆ｔＰＡ活性高于对照组１倍以上（Ｐ＜０．０５），而ＰＡＩ活性无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。提示：冠心病患者血浆ｔＰＡ活性下降，ＰＡＩ活性增高，纤溶活性普遍下降，血液趋于凝滞，临床应行活血化瘀的治疗方法。急性心肌梗塞患者血浆ｔＰＡ和ＰＡＩ的变化较复杂，随病程进展，在较短的时间后，纤溶功能下降需以较大灵活性辨证论治，随时更改药方。恶性肿瘤患者血浆ｔＰＡ活性明显增高，纤溶功能亢进，血粘度下降，对恶性肿瘤的局部浸润和全身转移有促进作用，故中医治疗应慎用活血化瘀攻法而应以扶正祛邪为治则，可获良效     

冠状动脉支架术患者血浆血小板激活因子含量的变化

冠状动脉(冠脉)支架术是救治急性冠脉综合征(ACS)及时而有效的手段。血小板激活因子(PAF)在各种感染和非感染性炎症反应的发生中起主要作用。我们观察了行与未行冠脉支架术ACS患者血浆PAF含量的变化，并与稳定型心绞痛(SA)患者及健康人进行比较，报告如下。     

Vpr对人结肠癌细胞的抑制作用及其机制

目的 探讨人类免疫缺陷病毒1型( HIV-1)病毒蛋白r(Vpr)对人结肠癌细胞HCT-8的抑制作用及其机制.方法 将细胞分为空白对照组、空载体转染组和Vpr转染组.空白对照组:细胞不予干预;空载体转染组:对数生长期的细胞加入不同感染复数(MOI)的空载体腺病毒;Vpr转染组:加入不同MOI的含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(Adv-Vpr).应用MTT比色法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡及线粒体膜电位,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白的表达.多组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验;或采用双因素方差分析,组内比较采用t检验.结果 Vpr显著抑制人结肠癌细胞HCT-8增殖,Adv-Vpr转染72 h后(MOI=200),Vpr转染组细胞MTT值为1.03±0.04,与空载体转染组(2.46 +0.15)及空白对照组(2.51±0.14)比较,差异有统计学意义(F=144.6,P＜0.05);Adv-Vpr转染48 h后(MOI=200),Vpr转染组处于G2/M期的细胞比例及线粒体膜电位下降的细胞比例增加,分别为37.31％±5.90％和32.07％±5.64％,与空载体转染组(18.30％±6.04％、3.32％±0.79％)及空白对照组916.66％±3.51％、2.76％±1.43％)比较,差异有统计学意义(F=10.08,64.45,P＜0.05).Adv-Vpr转染72 h后(MOI=200),Vpr转染组细胞凋亡率为37.62％±6.48％,与空载体转染组(3.44％±1.11％)及空白对照组(2.93％±1.07％)比较,差异有统计学意义(F=122.4,P＜0.05).Adv-Vpr处理48 h后(MOI=200),Westem blot检测发现Vpr导致了Caspase-9、Caspase-3剪切为活性片段,p-Chk1-S345磷酸化增加,而Fas、Fas-L、ERK1及ERK2表达未见上调.结论 Vpr在体外能够有效抑制结肠癌细胞株HCT-8增殖,并诱导其细胞周期G2期阻滞及凋亡,其机制分别与DNA损伤信号通路激活及线粒体凋亡通路启动有关.Vpr在结肠癌的治疗中具有潜在的应用前景.     

bFGF小分子干扰RNA诱导胶质瘤U251细胞凋亡作用的研究

目的:初步探讨以小分子干扰RNA沉默碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导胶质瘤细胞系U251凋亡的机制.方法:将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组,按4×105个细胞每孔接种于6孔细胞培养板,培养24h后,空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有bFGF小分子干扰RNA(siRNA)的重组腺病毒(rAd5-bFGF)转染,转染72h后检测各组细胞的凋亡及细胞周期变化情况及其相关蛋白的表达.结果:与正常对照组、空载体组比较,实验组U251细胞经转染bFGF-siRNA后出现了明显的细胞凋亡(P<0.05),但细胞周期未见变化(P>0.05);Western blot结果显示,实验组U251胶质瘤细胞经转染bFGF-siRNA 72 h后,bFGF蛋白表达明显降低,同时STAT3及Bcl-2蛋白表达降低,Bax及Caspase-3蛋白表达增强.结论:bFGF小分子干扰RNA能够诱导U251细胞凋亡,其作用可能是通过调节STAT3信号转导通路实现的.     

脓毒症大鼠脾脏淋巴细胞凋亡的实验研究

目的 观察脓毒症大鼠脾脏T、B淋巴细胞的数量变化及细胞凋亡情况,探讨脓毒症时免疫失衡的机制.方法 健康雄性Wistar大鼠80只,按随机数字表法分为假手术组(30只)、模型组(50只).采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症大鼠模型,于制模后6、12、24、48、96 h活杀动物取脾脏,行苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察脾脏组织病理变化;采用免疫组化法检测脾脏CD4~+、CD8~+T淋巴细胞和B淋巴细胞以及Bax、Bcl-2蛋白表达;采用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测脾脏细胞凋亡指数.结果 光镜下观察模型大鼠脾脏白髓逐渐萎缩,淋巴小结结构破坏.制模6、12、24、48、96 h,模型组大鼠脾脏CD4~+T淋巴细胞数、B淋巴细胞数、Bcl-2蛋白表达均较假手术组明显降低(P均<0.01),CD8~+T淋巴细胞数与假手术组比较差异无统计学意义(P均>0.05),细胞凋亡指数及Bax蛋白表达均较假手术组显著增加(P均<0.01).相关分析表明:Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡指数呈负相关(r=0.659,P<0.01),而Bax蛋白表达与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.522,P<0.01).结论 脓毒症早期免疫功能处于紊乱状态,表现为脾脏CD4~+T淋巴细胞数、B淋巴细胞数减少,细胞凋亡显著增加;Bax、Bcl-2在脓毒症脾细胞凋亡中发挥了关键作用.     

RNA干扰胰岛素样生长因子结合蛋白2基因治疗胶质瘤的体外实验研究

目的 研究与胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGF-BP2)对胶质瘤的抑制作用.方法 化学合成3条针对IGF-BP2的siRNA和1条阴性对照siRNA,采用小分子干扰RNA技术使胶质瘤U251细胞的IGF-Bit2基因沉默.通过逆转录PCR和免疫组化的方法检测IGF-BP2的表达,用MTT法检测干扰后U251细胞的增殖活性变化.结果 逆转录PCR检测表明转染后24 h IGF-BP2的mRNA表达明显降低,空白对照、阴性对照、脂质体、siRNA1、siRNA2、siRNA3组中IGF-BP2 mRNA水平分别为:0.88±0.02,0.87±0.03,0.84±0.02,0.65±0.03,0.55±0.04和0.64±0.02.48 h分别为0.93±0.04.0.90±0.04,0.93±0.03,0.76±0.04,0.58±0.03和0.75±0.02,72 h为0.95±0.04,0.95±0.03,0.94±0.02,0.78±0.05,0.60±0.02和0.76±0.03.3条siRNA中siRNA2作用最显著.免疫组织化学方法检测表明IGF-BP2的蛋白表达阳性率也由92.3%明显降低至24 h的15%,至48 h为52.5%,仍低于正常胶质瘤细胞.RNA干扰后胶质瘤细胞的MTT值虽在缓慢升高,于24 h相对于对照组差异无统计学意义,但至48 h和72 h均低于对照组(P＜0.05).结论 理想的IGF-BP2小分子干扰RNA序列能够抑制该基因的mRNA和蛋白的表达并能抑制胶质瘤细胞的增殖活性.     

血小板表达TLR4调节LPS刺激血小板释放细胞因子的作用

Objective To affirm the expression of Toll like receptor 4 (TLR4) on the surface membrane of platelet and to explore the immunomodulatory factors[(interlukine-8(IL-8),β-thromboglobulin(β-TG), soluble CD40 ligand(sCD40L)] released by platelets after platelets stimulated by TLR4 ligand.Methods TLR4 expressed on the platelet was detected by flow cytometry. Monoclonal anti-human FcγRⅡantibody(Ⅳ.3)-treated human platelets were cultured with LPS in the presence or absence of blocking monoclonal antibody to human TLR4. The release of IL-8, β-TG, sCD40L were measured by specific enzymelinked immunosorbent assay. Results Human platelets could express functional TLR4. The detection rate of TLR4 on platelets were decreased after LPS involvement(P<0.01). It was noted that sCD40L and β-TG were present in large concentration in the release of platelets stimulated by TLR4 ligand but the release of IL-8 was independent of platelet activation after TLR4 engagement. The concentration of sCD40L and β-TG had no statistical difference between 1-5 μg/ml LPS. The effects of LPS on the modulation of secretory factors were attenuated by preincubation of platelets with an anti-TLR4 monoclonal antibody. Conclusion The TLR4 on platelet could recognize and link LPS, induce the release of sCD40L, β-TG by platelet, but could not influence IL-8.     

补阳还五汤对脓毒症大鼠脾细胞凋亡的实验研究

目的 通过观察脓毒症大鼠脾脏T、B淋巴细胞数量、细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的变化,探讨补阳还五汤对脓毒症大鼠免疫功能的影响及其作用机制.方法 按随机数字表法将180只雄性Wistar大鼠分为假手术组(30只)、模型组(50只)及补阳还五汤治疗组(50只)和防治组(50只).采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症大鼠模型.治疗组于术后30 min、防治组于术前3 d灌胃补阳还五汤浓缩液(含生药1 g/ml)15 ml/kg,每日1次.分别于术后6、12、24、48、96 h处死大鼠,观察各组动物脾脏形态学变化,脾T、B淋巴细胞,凋亡细胞,Bcl-2、Bax蛋白表达的变化.结果 光镜下观察CLP术后大鼠脾脏白髓逐渐萎缩,淋巴小结破坏,损伤的严重程度为模型组＞治疗组＞防治组.与假手术组比较,模型组术后各时间点CD4+T淋巴细胞、CD40 B淋巴细胞、Bcl-2蛋白表达明显降低,凋亡细胞、Bax蛋白表达明显增加,均于24 h达谷值或峰值[均为积分吸光度(A)值:CD4+T淋巴细胞:18.28±4.57比98.60±18.18;CD40 B淋巴细胞:26.96+6.26比104.87±30.97;Bcl-2蛋白表达:20.23±11.75比149.67±5.24;凋亡细胞:241.75±44.79比14.67±5.24;Bax蛋白表达:128.75±44.79比5.34±4.26,均P＜0.01];而CD8+淋巴细胞无明显变化.与模型组比较,补阳还五汤治疗组和防治组各时间点脾脏CD4+T淋巴细胞、CD40B淋巴细胞明显升高,凋亡细胞、Bax蛋白表达明显减少,而CD8+T淋巴细胞、Bcl-2蛋白表达无明显变化;防治组治疗效果优于治疗组(A值:CD4 +T淋巴细胞:94.12±15.45比72.37±8.00;CD40 B淋巴细胞:90.46±13.34比55.66±4.23;凋亡细胞:27.63±9.91比40.83±16.09;Bax蛋白表达:11.63±5.91比30.83±16.09,P＜0.05或P＜0.01);至96 h时各指标逐渐接近假手术组水平.细胞凋亡与Bax呈显著正相关(r=0.522,P=0.000),与Bcl-2呈显著负相关(r=-0.659,P=0.000).结论 补阳还五汤通过减少脾脏CD4+T淋巴细胞、B淋巴细胞凋亡,从而改善脓毒症时的免疫抑制;这可能与补阳还五汤减弱Bax对细胞凋亡的促进作用相关.     

重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究

目的 探讨重组腺病毒介导的人类免疫缺陷病毒1型病毒蛋白R(HIV1-Vpr)体外对胶质瘤细胞U251凋亡的影响.方法 将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组进行细胞培养,24 h后空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有HIV1-Vpr基因的重组腺病毒(rAd5-Vpr)转染,转染后用MTT比色法测定细胞增殖活性,用Hoechst染色和流式细胞仪分别检测细胞的凋亡和细胞周期改变,用Western blot方法 检测相关蛋白的表达.结果 rAd5-Vpr能够抑制U251细胞增殖,其作用从转染后48 h开始,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强(P＜0.05);实验组Hoechst染色观察到明显的细胞凋亡现象;流式细胞周期检测显示实验组细胞G2期比例升高(P＜0.05);Western blot结果 显示,实验组U251细胞经转染rAd5-Vpr72 h后,可见Vpr蛋白表达,同时Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase3和Fas-L蛋白表达增强.结论 rAd5-Vpr在体外能够抑制U251细胞增殖,诱导细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡.     

诱导C57鼠获得抗β淀粉样蛋白抗体的新途径

目的探讨诱导C57鼠产生β淀粉样蛋白抗体的新途径。方法收获小鼠骨髓细胞,定向培养为树突状细胞（DCs）,培养期间加用突变型β淀粉样蛋白1-42多肽刺激致敏。流式细胞仪测定收获的DCs成熟度。将致敏DCs作为疫苗接种至C57鼠,以β淀粉样蛋白＋氟氏佐剂接种作为阳性对照,用间接ELISA法测定小鼠的抗β淀粉样蛋白抗体滴度。结果用突变型β淀粉样蛋白刺激DCs可促进其表面CD11c、CD86、MHC-Ⅱ及CD80分子表达从54.69%、76.68%、44.77%和58.65%分别提高到77.49%、92.76%、85.52%和75.57%。接种DCs后14d抗β淀粉样蛋白抗体滴度开始逐渐升高,一直持续到免疫后35d仍未见降低。相对于佐剂疫苗7d显著升高、21d达峰的变化曲线有所平缓和滞后。DCs疫苗免疫后平均抗体滴度最高达到2425.17倍,但比佐剂疫苗组要低（平均最高3200倍）。结论采用DCs疫苗能有效地诱导C57鼠产生足够的抗β淀粉样蛋白抗体。