干扰α烯醇化酶对耐药细胞株K562/A02耐药性的影响

目的肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,α烯醇化酶(eno1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关。探究eno1对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02生长及耐药的影响。方法筛选3株稳定干扰eno1的细胞系K562/A02-sheno1和对照细胞系K562/A02-shcon;采用细胞计数法测定细胞生长速率,MTT法测定细胞增殖能力,细胞内罗丹明123含量测定细胞外排药物能力,real-time PCR反应测定基因mRNA表达水平,Western blot实验测定基因蛋白表达水平。结果与敏感性细胞株K562相比,eno1在耐药细胞株K562/A02中为高表达状态,其在mRNA水平和蛋白水平表达分别增高(2.85±0.56)倍和(1.43±0.05)倍;而K562/A02细胞生长速率与K562细胞相比差异无显著性。K562/A02-sheno1细胞系与对照组K562/A02-shcon相比生长速率降低,对抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增强,且K562/A02-sheno1细胞系中罗丹明123含量也明显增高。K562/A02-sheno1细胞系中耐药相关基因MDR1表达水平降低。结论稳定干扰eno1表达能抑制K562/A02细胞生长,有效逆转K562/A02细胞耐药性,提高其对药物的敏感性,其机制与MDR1基因表达相关。     

低剂量5-Fu与Ad- IL24联用对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及其机制

 目的 探讨低剂量5-Fu与腺病毒表达的IL24联用对HepG2细胞的生长抑制作用及其机制。方法 采用PCR、酶切、连接等方法构建pAd-IL24腺病毒表达载体,Western blot检测IL24蛋白水平表达情况。CCK8法确定5-Fu联用剂量,检测与Ad-IL24联用对HepG2肝癌细胞的抑制效果,并计算联合指数。流式细胞术检测不同腺病毒感染复数及不同5-Fu浓度下绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）阳性细胞的比例。流式细胞术检测5-Fu作用前后HepG2细胞表面柯萨奇腺病毒受体（coxsackie adenovirus receptor, CAR）的表达变化。结果 成功构建腺病毒表达载体pAd-IL24。确定5-Fu联用剂量为1 μg/ml和2 μg/ml,Ad-IL24与低剂量5-Fu联用可以协同抑制HepG2肝癌细胞生长,联合指数分别为0.75和0.64。低剂量5-Fu作用于HepG2后使其表面CAR水平显著增加（P<0.01）。结论 低剂量5-Fu与Ad-IL24联用对HepG2肝癌细胞系的抑制有协同作用,可能与5-Fu上调HepG2表面CAR水平相关。     

IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用

目的：构建以IL-3为靶向、力达霉素（lidamycin,LDM）为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。 方法: 原核表达IL-3-LDP（interleukin 3-lidamycin）融合蛋白,组装活性烯二炔（active enediyne,AE）发色团得到IL-3-LDM。流式细胞术检测不同白血病细胞系（KG1-a、TF-1、M07e、HL-60、K562、Raji）表面CD123分子的表达,并检测融合蛋白IL-3-LDM与各白血病细胞的结合能力;CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白对不同CD123阳性率的白血病细胞的杀伤能力。 结果: 组装活性发色团得到的IL-3-LDM蛋白纯度可达90%以上。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）KG-1a细胞表面CD123阳性率最高（88.9%）,其次为MO7e和TF-1细胞（＞75%）,再次为HL-60细胞（7.8%）,而K562、Raji细胞CD123表达呈阴性。体外IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞(KG-1a、MO7e、TF-1和HL-60细胞）的结合能力和杀伤效率与细胞表面CD123的阳性率成正比,对于CD123表达率最高的KG-1a细胞,LDM的杀伤强度是多柔比星（adriamycin, ADR)的1 415.8倍,而IL-3-LDM 的杀伤强度又是LDM的9.6倍。 结论: IL-3-LDM融合蛋白可以有效携带细胞毒药物LDM 并高效靶向杀伤CD123+白血病细胞。     

印苦楝内酯通过阻滞细胞周期和上调p21蛋白抑制结肠癌细胞HT-29的增殖

印苦楝内酯(nimbolide)是从楝Azadirachta indica A.种子中提取的天然三萜类化合物,作者研究了该化合物对人结肠癌HT-29细胞生长的抑制作用。分别进行了细胞生长试验、细胞周期分析、DNA片断分析、Annexin V-PI实验、蛋白质印迹分析和碱性磷酸酶活性检测。结果显示,印苦楝内酯抑制HT-29细胞生长的作用具有浓度和时间相关性,以其(浓度为2.5~10μmol/L)处理细胞12、48h,抑制率分别为35%~68%和57%~89%。用2.5μmol/L的印苦楝内酯处理HT-29细胞12h,停滞在G2/M期的细胞数比对照组增加了6.5倍;且随作用时间的延长,在G2/M期细胞数的增加的…     

利用PTD介导的新型大分子转染方法

 目的：构建融合蛋白PTD-Strep,用于转染常规操作中难于转染生物大分子的血液肿瘤细胞、神经细胞、干细胞等细胞系。方法：采用PCR法引入PTD和G4S序列、扩增链亲合素streptavdin序列;经酶切、连接构建重组质粒pAYZ-PTD-Strep,低磷培养基AP5诱导表达融合蛋白,E-tag亲和层析柱纯化产物,Western blot鉴定产物,FACS测定融合蛋白转染效率。结果：目的产物PTD-G4S-Strep融合蛋白以可溶形式表达,产量约为0.7 mg/L,经E-tag亲和层析柱纯化后纯度可达90%以上。融合蛋白PTD-Strep可成功将质粒运送至悬浮细胞U937内,转染效率高于PTD单体。结论：构建的融合蛋白pAYZ-PTD-Strep具有将生物大分子转入血液肿瘤悬浮细胞内的活性,有望发展成为一种高效、可靠的真核细胞转染方法。     

富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪切因子:预测血液肿瘤耐药的潜在靶点

 【摘要】　目的　鉴定血液肿瘤细胞耐药相关膜抗原,探讨其在血液肿瘤细胞膜易位表达的普遍性。方法　以蛋白电泳和免疫共沉淀法分离并沉淀细胞膜抗原,以质谱分析鉴定抗原信息,通过siRNA基因干扰法和激光共聚焦显微镜法确证抗原信息及其易位细胞膜的鉴定结果,通过流式细胞术检测抗原在多种血液肿瘤细胞膜的易位表达。结果　免疫共沉淀和质谱等实验证实白血病耐药相关单抗———5D12在HL-60细胞膜抗原为细胞核因子富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪切因子（PSF）,经一系列生物学实验确证PSF在HL-60细胞膜的易位表达,在敏感株的膜表达显著高于耐药株的膜表达。流式细胞术检测结果表明PSF的特异性单抗5D12与血液肿瘤多种细胞系的膜结合率为：HL-60（78.56±0.76）%;K562（26.54±4.42）%;Nomalwa（38.10±5.11）%;U937（64.03±7.96）%;Jurkat（29.12±5.58）%;Raji（74.92±3.41）%;CEM（12.18±3.21）%。结论　核蛋白PSF易位表达于多种血液肿瘤细胞膜,对维持肿瘤细胞对化疗药的敏感性有重要作用,是血液肿瘤耐药预测的候选靶点。     

PHⅡ-7通过升高ROS诱导K562和K562/A02凋亡

目的探讨靛玉红衍生物——PHⅡ-7对K562和K562/A02的体外杀伤作用及其机制。方法利用WST-8试剂盒、细胞凋亡检测以及活性氧(ROS)检测研究PHⅡ-7对K562和K562/A02发生杀伤作用的机制。共聚焦显微镜及Western blot分析观察药物处理前后细胞的变化。结果细胞毒实验证实PHⅡ-7对K562和K562/A02有相近的杀伤作用。给予上述两种细胞2μmol·L-1PHⅡ-7可见明显的ROS水平升高。PHⅡ-7对K562及K562/A02具有诱导凋亡的作用,呈剂量依赖性。加入ROS的抑制剂NAC可抑制给药后细胞内ROS水平的提高,同时也抑制了PHⅡ-7处理后细胞的凋亡。共聚焦显微镜观察发现药物处理的K562和K562/A02细胞出现明显的凋亡形态改变,Western blot分析表明单用PHⅡ-7可以引起PARP-1及caspase-3,caspase-9的切割,当PHⅡ-7与NAC共同作用之后,上述改变均被抑制。结论 PHⅡ-7可以通过诱导K562/和K562/A02凋亡来实现对上述细胞的杀伤作用,该作用很有可能与其升高细胞内的ROS水平有关。     

4-1BBL胞膜外区蛋白增强抗CD3/抗PgP的抗肿瘤作用

目的研究4-1BBL胞膜外区蛋白对抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体抗肿瘤作用的影响。方法表达纯化人4-1BBL胞膜外区融合蛋白及抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体,体外CytoTox96检测联合应用人4-1BBL胞膜外区融合蛋白、抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体及PBL对靶细胞K562/A02细胞的杀伤作用,体内建立裸鼠移植瘤模型检测4-1BBL胞膜外区蛋白作为一种免疫调节蛋白,增强抗CD3/抗Pgp基于PBL的抗肿瘤效果。结果4-1BBL胞膜外区融合蛋白在体外能够增强抗CD3/抗Pgp及PBL对靶细胞K562/A02的杀伤作用,在体内能够增强抗CD3/抗Pgp基于PBL的抗肿瘤作用。结论可溶型4-1BBL可能成为一种有前景的生物治疗佐剂,有助于PBL更高效地靶向杀伤肿瘤细胞。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对多药耐药MCF-7/ADR和KBV/200细胞增殖及细胞周期影响作用机制的研究

目的:探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)对肿瘤多药耐药细胞生长抑制率、细胞周期的影响及可能的作用机制。方法:采用MTT法检测5-Aza-dC对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR、口腔表皮癌多药耐药细胞KBV/200及其相应的亲本敏感MCF-7和KB细胞的生长抑制率;FCM法检测不同浓度5-Aza-dC(1、5和10μmol/L)作用72h及5-Aza-dC(10μmol/L)作用24、48和72h后,各细胞周期分布的变化;分别采用实时荧光定量-PCR及蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin E和p21waf1/cip1mRNA及蛋白的表达情况。结果:5-Aza-dC对耐药细胞株MCF-7/ADR及KBV/200均呈现明显的生长抑制作用,细胞周期被阻滞在G2/M期,并呈时间及剂量依赖性;细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin E和p21waf1/cip1mRNA及蛋白的表达均上调。结论:5-Aza-dC可以通过使MCF-7/ADR及KBV/200细胞的细胞周期被阻滞在G2/M期,从而抑制肿瘤多药耐药细胞的增殖;其作用机制可能与上调细胞周期相关蛋白cyclin A、cyclin E和p21waf1/cip1的表达有关。     

人脐带来源间充质干细胞向HepG2肝癌细胞原位移植瘤的归巢及分化

目的:观察人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,HUMSC)向HepG2肝癌细胞原位移植瘤的归巢及分化.方法:二步法体外诱导HUMSC向肝细胞分化,通过Real-time PCR和Western blotting检测不同时间点HUMSC中肝细胞特异性基因甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)及白蛋白(albumin,ALB)mRNA和蛋白水平的变化;Transwell实验观察HUMSC在HepG2肝癌细胞条件培养基作用下的趋化现象;采用皮下-原位移植的方法建立BALB/c裸鼠的HepG2肝癌细胞原位移植瘤模型,利用慢病毒感染的方法将HUMSC标记CMV或AFP启动子驱动的fLuc,制备成MSC.CMVLuc或MSC.AFPLuc,并将其注射入荷瘤肝组织,IVIS成像系统观察MSC.CMVLuc向肿瘤部位的迁移归巢及MSC.AF-PLuc在肝癌微环境中向肝细胞分化.结果:HUMSC在体外诱导培养过程中出现细胞形态学变化证明其向肝细胞分化,同时诱导培养后AFP、ALB mRNA和蛋白的表达明显升高(均P＜0.05);HUMSC向HepG2肝癌细胞的趋化呈瘤细胞密度依赖性(P ＜0.01);MSC.CMVLuc注射后2d迁移并聚集于肝脏,注射后5d肝脏内发光信号进一步增强;MSC.AFPLuc肝内注射后24h已向肝细胞分化,注射第7天AFP启动子活性最强,注射第9天活性消失.结论:在小鼠体内外证明了HUMSC具有向肝脏归巢及分化的能力,为今后MSC应用于肝癌基因靶向治疗提供了一种新的策略.