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1.
目的探讨补阳还五汤抗大鼠脑缺血/再灌注损伤的AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路机制。方法用改良线栓法建造大鼠左侧脑缺血模型,各组大鼠每24 h给药1次,共3次。再灌注72 h后观察大鼠神经损伤情况和脑梗死体积改变;尼氏染色法和TUNEL染色法观察神经细胞形态、数量以及凋亡情况;Western blot检测自噬蛋白和AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路相关蛋白表达情况。结果补阳还五汤改善大鼠神经功能缺陷,减少脑梗死体积和神经细胞凋亡,减轻脑组织病理损伤;抑制AMPK磷酸化活化,解除AMPK对下游mTOR和ULK1的抑制,促进二者磷酸化激活,抑制细胞自噬。AMPK激动剂Metformin提高细胞自噬水平,同时逆转了补阳还五汤抗大鼠脑缺血/再灌注损伤作用。结论补阳还五汤介导AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路对脑缺血/再灌注损伤大鼠发挥神经保护作用。  相似文献   
2.
目的:探讨18kDa转运蛋白(translocator protein,TSPO)是否可以通过激活脊髓背角星形胶质细胞自噬来缓解神经病理性疼痛及其可能的机制。方法:实验分为两部分,第一部分将雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、对照组(SNL组)、TSPO受体激动剂Ro5-4864处理组(Ro组);第二部分将脊神经结扎模型(spinal nerve ligation,SNL)术后的雄性SD大鼠随机分为TSPO受体激动剂Ro5-4864处理组(Ro组)和自噬诱导剂Rapamycin处理组(Rap组)。采用von Frey纤维丝测量大鼠50%机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT),在术后第7天(D7)、14天(D14)取损伤侧脊髓样本,采用蛋白印迹技术检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3、p62及通路蛋白PGC-1α,采用免疫荧光检测LC3在脊髓背角星形胶质细胞的表达。结果:第一部分实验结果:与Sham组相比,SNL组50%MWT从术后第1天开始明显下降,持续到观察结束,脊髓Beclin1、LC3、p62表达明显升高(P<0.01),脊髓PGC-1α表达明显降低,脊髓背角星形胶质细胞LC3表达信号增强;与SNL组相比,Ro组50%MWT在D7、D14明显升高,Ro组脊髓Beclin1、LC3表达明显升高(P<0.01),p62蛋白含量先升高后降低,PGC-1α持续升高,显著高于同时间SNL组(P<0.01)。第二部分实验结果:与Ro组相比,Rap组50%MWT在D7降低,Rap组脊髓D14 Beclin1及D7、D14 LC3差异有统计学意义(P<0.01)。结论:鞘内注射TSPO受体激动剂Ro5-4864能显著缓解神经病理性疼痛,其涉及机制之一可能为通过激活PGC-1α相关途径,而后激活脊髓背角星形胶质细胞的自噬。  相似文献   
3.
TP53 is the most frequently mutated gene in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Patients with HPV-negative TP53 mutant HNSCC have the worst prognosis, necessitating additional agents for treatment. Since mutant p53 causes sustained activation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, we investigated the effect of rapalogs RAD001 and CCI-779 on HPV-negative mutTP53 HNSCC cell lines and xenografts. Rapalogs significantly reduced cell viability and colony formation. Interestingly, rapalogs-induced autophagy with no effect on apoptosis. Pretreatment with autophagy inhibitors, 3-methyladenine (3-MA) and ULK-101 rescued the cell viability by inhibiting rapalog-induced autophagy, suggesting that both RAD001 and CCI-779 induce non-apoptotic autophagy-dependent cell death (ADCD). Moreover, rapalogs upregulated the levels of ULK1 and pULK1 S555 with concomitant downregulation of the mTORC1 pathway. However, pretreatment of cells with rapalogs prevented the ULK-101-mediated inhibition of ULK1 to sustained autophagy, suggesting that rapalogs induce ADCD through the activation of ULK1. To further translate our in vitro studies, we investigated the effect of RAD001 in HPV-negative mutTP53 (HN31 and FaDu) tumor cell xenograft model in nude mice. Mice treated with RAD001 exhibited a significant tumor volume reduction without induction of apoptosis, and with a concomitant increase in autophagy. Further, treatment with RAD001 was associated with a considerable increase in pULK1 S555 and ULK1 levels through the inhibition of mTORC1. 3-MA reversed the effect of RAD001 on FaDu tumor growth suggesting that RAD001 promotes ACDC in HPV-negative mutTP53 xenograft. This is the first report demonstrating that rapalogs promote non-apoptotic ADCD in HPV-negative mutTP53 HNSCC via the ULK1 pathway. Further studies are required to establish the promising role of rapalogs in preventing the regrowth of HPV-negative mutTP53 HNSCC.  相似文献   
4.
目的 探究异丹叶大黄素(ISO)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用及潜在机制。方法 体外培养RAW264.7细胞,采用不同浓度ISO处理细胞,CCK-8法检测细胞活力。使用200 ng/ml LPS诱导RAW264.7细胞,以ISO、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)进行干预,Western blot检测各组细胞中炎症介质白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、P65、磷酸化P65(p-P65)、IκB、磷酸化IκB(p-IκB)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)、高迁移率组蛋白B1(HMGB1)以及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、P62的表达,DCFH-DA探针检测各组细胞内活性氧(ROS)的变化。采用腹腔注射LPS(15 mg/kg)方法构建小鼠ALI模型,HE染色观察各组肺组织形态的病理变化,Western blot检测各组肺组织中炎症介质和自噬相关蛋白的表达,流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中ROS的含量。结果 ISO可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、HMGB1的表达,抑制ROS的产生,促进LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表达,降低P62的表达,激活自噬通路(P均<0.05);当使用自噬抑制剂3-MA干预后可显著增加p-P65/P65、p-IκB、iNOS、COX-2、HMGB1的表达且降低IκB的表达(P均<0.001),并促进ROS的产生。ISO能够改善LPS诱导的ALI小鼠的肺组织病理变化,显著抑制肺组织中p-P65/P65、p-IκB、iNOS、COX-2、HMGB1的表达且促进IκB的表达(P均<0.001),减少BALF中ROS的含量,3-MA则会逆转ISO的保护作用。结论 ISO对LPS诱导的ALI小鼠具有保护作用,其机制可能与ISO激活巨噬细胞自噬有关。  相似文献   
5.
目的:探讨miR-152通过靶向成纤维细胞生长因子2(FGF2)对肺癌A549细胞系的增殖和侵袭的作用机制。方法:通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测正常上皮细胞BEAS-2B和肺癌A549细胞中miR-152和FGF2的表达情况;采用转染技术,分别特异性表达肺癌A549细胞系中miR-152和FGF2基因的表达。将肺癌A549细胞系分为6组:miRNA 空转组(miR-NC组)、miR-152 过表达组(miR-152 mimics组)、miR-152 抑制组(miR-152 inhibitor组)、FGF2过表达空转组(pcDNA3.1-NC组)、FGF2过表达组(pcDNA3.1-FGF2组)和miR-152过表达+FGF2过表达组(miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组)。通过qPCR检测A549细胞系中miR-152和FGF2的表达水平;细胞克隆和Transwell小室实验分别检测A549细胞系的增殖和侵袭能力;采用双荧光报告基因法验证miR-152与FGF2结合情况;Western印迹法检测A549细胞系中FGF2、自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)Ⅱ/Ⅰ、beclin1和p62的表达量。结果:qPCR结果显示,与正常上皮细胞BEAS-2B比较,肺癌A549细胞中miR-152的表达量显著降低(P<0.01),而FGF2的表达量显著增加(P<0.01)。TargetScan生物信息学软件预测显示miR-152与FGF2的3′UTR结合,双荧光报告基因检测结果显示,miR-152与FGF2直接结合。细胞克隆和Transwell小室实验结果显示,与miR-NC组比较,miR-152 mimics组中的A549细胞系的增殖和侵袭能力显著减低(P<0.05),miR-152 inhibitor组的增殖和侵袭能力显著增加(P<0.05)。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-FGF2组中的A549细胞系的增殖和侵袭能力显著增加(P<0.05)。与miR-152 mimics组比较,miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组中A549细胞系的增殖和侵袭能力显著增加(P<0.05)。Western印迹结果显示,与miR-NC组比较,miR-152 mimic组FGF2和p62蛋白表达显著降低(P<0.05),但LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1的表达量显著增加(P<0.05),而miR-152 inhibitor组结果与之相反。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-FGF2组FGF2和p62蛋白表达显著增加(P<0.05),而LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1的表达量显著降低(P<0.05)。与miR-152 mimics组比较,miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组FGF2和p62蛋白表达显著增加(P<0.05),LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论:miR-152靶向FGF2抑制肺癌A549细胞系自噬,从而降低增殖侵袭能力,可成为肺癌临床治疗的新靶点。  相似文献   
6.
目的 探讨丹酚酸B对高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡、自噬及AMPK信号通路的影响。方法 提取大鼠视网膜原代Müller细胞,随机分为对照组、高糖组、高糖+丹酚酸B组、高糖+ AMPK抑制剂Dorsomorphin(DS)组、高糖+DS+丹酚酸B组、高糖+AICAR组和高糖+AICAR+丹酚酸B组。其中,对照组细胞给予5 mmol·L-1葡萄糖处理,高糖为35 mmol·L-1高浓度葡萄糖,丹酚酸B浓度为40 μmol·L-1,DS浓度为10 μmol·L-1,AICAR浓度为1 mmol·L-1 。MTT法检测各组细胞活力,Hoechst 33258染色观察各组细胞凋亡情况,qRT-PCR检测各组细胞自噬相关基因Beclin1和LC3-II mRNA的表达,Western blot检测各组细胞Beclin1、LC3-I、LC3-II、p-AMPK、AMPK、Bax和Bcl-2蛋白表达情况。结果 与对照组比较,高糖组细胞Beclin1、LC3-II、p-AMPK、Bcl-2蛋白及Beclin1、LC3-II mRNA表达均显著减少(均为P<0.01),Bax蛋白表达增加(P<0.01),细胞活力降低(P<0.01),细胞核浓缩和DNA片段化加剧,凋亡亢进。与高糖组比较,高糖+丹酚酸B组和高糖+AICAR+丹酚酸B组细胞Beclin1、LC3-II、p-AMPK、Bcl-2蛋白及Beclin1、LC3-II mRNA表达均显著增加(均为P<0.05),Bax蛋白表达均显著减少(均为P<0.01),细胞活力增加,细胞核浓缩和DNA片段化改善,凋亡被抑制;高糖+DS+丹酚酸B组细胞Beclin1、LC3-II、p-AMPK、Bcl-2、Bax蛋白表达及细胞活力均无显著变化(均为P>0.05),细胞核浓缩和DNA片段化无显著变化。各组细胞间LC3-I和AMPK蛋白表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论 丹酚酸B可通过激活AMPK信号显著增强细胞自噬而抑制Müller细胞凋亡,从而对高糖诱导的Müller细胞起到保护作用。  相似文献   
7.
Although comprehensive exertions have been made in late decades for treating advanced lung cancer with inclusive therapies but efficient anti-lung cancer therapeutics are statically inadequate in the clinics. Hence, compelling novel anti-lung cancer drugs are considerably desired. This backdrop enticed us to unveil anticancer efficacy of astrakurkurol, derivative of wild edible mushroom against lung cancer, whose effects have not yet been described. Mechanistic analysis disclosed that sensitizing effect of astrakurkurol is due to cell cycle arrest at G0/G1 phase, increased level of Fas, FADD, decreased ratio of Bax/Bcl-2, and increased cleaved form of caspase 9, 8, and 3. Apart from the induction of apoptosis, it was demonstrated for the first time that astrakurkurol induced an autophagic response as evidenced by the development of acidic vesicular organelles (AVOs) with up-regulation of beclin-1, Atg7, and downregulated p62. Apoptosis and autophagy can be sparked by the same stimuli, which was as evident from the astrakurkurol-induced inactivation of PI3K/AKT signaling. The thorough scanning of the mechanism of crosstalk between apoptosis and autophagy is requisite for prosperous anticancer remedy. Triterpenoid has evidently intensified cytotoxicity, induced apoptosis and autophagy on A549 cells. Besides astrakurkurol could also curb migration and regress the size of tumor in ex ovo xenograft model. All these findings put forth astrakurkurol as a convincing novel anti-cancer agent, for scrutinizing the lung cancer therapies and as a robust contender for future in vitro and in vivo analysis.  相似文献   
8.
目的 研究7-羟乙基白杨素(7-HEC)对高原脑水肿(HACE)的可能作用机制。方法 建立大鼠高原脑水肿模型,测定大鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量,采用蛋白质印迹法检测细胞凋亡、周期及自噬相关蛋白的表达水平,探究7-HEC对高原脑水肿的保护作用及其机制。结果 与对照组相比,缺氧模型组大鼠脑组织中MDA含量显著上调,SOD活力显著下调,周期蛋白CyclinD1、CyclinE1、CDK6、CDK2,凋亡蛋白Bcl-2、PARP,自噬蛋白LC3-B相对表达下调,凋亡蛋白Bax,自噬蛋白P62的相对表达上调,差异均具有统计学意义(P<0.05);与缺氧模型组相比,7-HEC给药组MDA含量下调,SOD活力显著上调,周期蛋白CyclinD1、CyclinE1、CDK6、CDK2,凋亡蛋白Bcl-2、PARP,自噬蛋白LC3-B的相对表达上调,凋亡蛋白Bax,自噬蛋白P62的相对表达下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 7-HEC对高原脑水肿具有一定的保护作用,其机制可能与调控细胞周期、自噬、凋亡以及氧化应激等通路有关。  相似文献   
9.
目的:研究异甘草素(isoliquiritigenin,ISL)对人肾透明细胞癌786-O细胞的抗癌作用,并探讨其可能存在的分子机制。方法:通过噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)比色法检测ISL(0,10,25,50,75,100μmol·L~(-1))对786-O细胞增殖的作用;细胞划痕和Transwell实验检测ISL对786-O细胞迁移、侵袭能力的影响;吖啶橙染色,Ad-GFP-LC3转染实验观察细胞自噬状态;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白的表达,并分析磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路变化,探讨其可能的作用机制。结果:MTT比色法结果显示,与空白组比较,ISL能够明显抑制786-O细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖性(P0.05);划痕和Transwell实验结果表明,与空白组比较,ISL能够抑制785-O细胞的迁移和侵袭(P0.05);吖啶橙染色和Ad-GFP-LC3转染实验表明ISL能够诱导786-O细胞发生自噬。此外,与空白组比较,ISL能够诱导细胞内自噬标志物-Ⅱ(LC3-Ⅱ),自噬相关蛋白Beclin1,Atg5蛋白表达(P0.05),并显著下调p62蛋白表达(P0.05),当加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)可逆转上述现象(P0.05);同时ISL能够抑制Akt,m TOR的磷酸化水平(P0.05),加入抑制剂LY294002和雷帕霉素(rapamycin,Rap),LC3-Ⅱ,Beclin1,Atg5蛋白表达明显上调(P0.05),p62蛋白表达明显下调(P0.05)。结论:ISL能够抑制肾透明细胞癌786-O细胞的增殖、迁移和侵袭,并通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导细胞发生自噬。  相似文献   
10.
目的:探讨脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响。方法:72只大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组(分别再灌0、6、12、24、36 h),每组12只。采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。神经功能缺损评分评价大鼠海马神经功能,HE染色检测大鼠海马神经细胞损伤,透射电镜下观察海马神经元内自噬小体,Western blot检测Beclin-1、LC3 II、p62、p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表达。结果:与假手术组比,随着脑缺血再灌注的时间延长,脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、自噬小体数量均增加(均P<0.05);随着脑缺血再灌注的时间延长,大鼠海马组织自噬相关蛋白Beclin-1和LC3 II表达显著上调、p62表达下调(P<0.05);PI3K/mTOR通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达显著下调(P<0.05)。结论:脑缺血再灌注可增强大鼠海马神经元自噬,抑制PI3K/mTOR信号通路。  相似文献   
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