鱼藤酮处理大鼠脑内VMAT2及TPH、5-HT的表达改变

目的观察鱼藤酮处理大鼠脑内单胺囊泡转运体2(VMAT2)。色氨酸羟化酶(TPH)及5—羟色胺(5—HT)的表达变化;探讨其对5—HT能神经元的影响及可能机制。方法选用健康、成年雄性Wistar大鼠,背部皮下注射鱼藤酮3d或28d制作大鼠动物模型;利用免疫细胞化学分析VMAT2在大鼠黑质、中缝背核和尾壳核以及TPH、5—HT在中缝背核的表达变化;以透射电镜观察轴突超微结构的改变,探讨鱼藤酮毒性作用的可能机制。结果鱼藤酮3d组:(1)鱼藤酮组大鼠黑质、中缝背核VMAT2的表达增加,免疫反应强度吸光度值显著高于对照组;尾壳核VMAT2的表达减弱,免疫反应强度吸光度值明显低于对照组(P0.01);(2)鱼藤酮组大鼠中缝背核TPH、5—HT的表达减少,免疫反应强度吸光度值显著低于对照组(P0.01);(3)透射电镜观察显示鱼藤酮处理大鼠中缝背核轴突变性、其内微管解聚。鱼藤酮28d组:(1)鱼藤酮组大鼠黑质、中缝背核及尾壳核VMAT2的表达均减弱,免疫反应强度吸光度值显著低于对照组(P0.01或P0.05);(2)与对照组相比,鱼藤酮组大鼠中缝背核TPH、5—HT的表达降低,免疫反应强度吸光度值显著低于对照组(P0.01)。结论鱼藤酮降低5—HT能神经元TPH、5—HT的表达,其毒性作用可能与轴突微管解聚导致突触囊泡VMAT2轴浆顺行转运障碍有关。     

构建SD大鼠鱼藤酮中毒模型及其线粒体DNA突变的初步探索

目的构建SD大鼠鱼藤酮慢性中毒模型,同时对SD大鼠组织标本(脑组织和肝脏)进行线粒体DNA突变的初步探索,为后续实验提供线索。方法将75只雄性SD鼠随机分为三组,实验组:0.5 mg/(kg·d)鱼藤酮皮下注射4~8周,共45只;空白组:不予任何特殊处理4~8周,共15只;对照组:相同体积的二甲基亚砜(DMSO)皮下注射4~8周,共15只。其中实验组随机分为1、2、3小组,每小组15只;空白组和对照组也分别分为1、2、3小组,每小组5只。每组内相应的1、2、3小组分别在实验的第4、6、8周处死老鼠并留取相应的组织标本(中脑组织和肝脏),存储于-80℃冰箱中待用。在实验组的每个小组内分别随机选取3对组织标本,共9对;在空白组和对照组的每个小组内分别随机选取1对组织标本,共6对。随后进行组织DNA提取,采用2对引物进行长PCR并将PCR产物进行凝胶电泳分析,同时设计并利用线粒体DNA引物,用一代测序的方法进行线粒体全基因组测序。实验中观察各组大鼠的一般情况并进行行为学测试。结果1)实验组大鼠在实验中表现出较为明显的中毒症状。在体重增长速度上与对照组和空白组存在明显差异(P0.05)。在行为学上,实验组大鼠亦表现出了较为明显的行为学异常(P0.05)。2)大鼠脑以及肝脏组织的长PCR凝胶电泳结果未发现明显的异常条带;所有测序突变(缺失、插入、点突变)均为大鼠固有突变。结论 0.5 mg/(kg·d)鱼藤酮皮下注射4~8周可导致SD大鼠鱼藤酮慢性中毒。SD幼鼠的选择、鱼藤酮剂量及作用时间、一代测序等多种因素可能是导致本次实验未检测到有意义的线粒体DNA突变的原因。因此,后续实验应做相应改进。     

百可利通过调控自噬抗帕金森病的作用机制

目的帕金森病是以运动障碍为主的多巴胺能神经元退行性疾病,其特征性病变是神经元内可见路易小体,α-突触核蛋白聚集形成难以清除的寡聚体。细胞自噬有助于清除胞内损伤的细胞器与蛋白,维持细胞稳态,而α-突触核蛋白寡聚体的清除能力下降可能与胞内自噬障碍有关。百可利通过调节氧化应激与炎症反应、促进寡聚体清除等多种途径发挥神经保护作用,而这种保护作用可能与调控自噬过程有关。方法建立鱼藤酮损伤SH-SY5Y细胞模型,考察百可利对SH-SY5Y细胞的保护作用。Western蛋白印迹法考察鱼藤酮损伤与百可利作用后细胞内α-syn变化,并探究不同时间点下自噬标志性蛋白LC3B表达变化。选取适宜的损伤时间,提取不同组别细胞总蛋白,观察不同浓度的百可利对LC3B表达的影响。通过免疫荧光直接观察细胞中LC3B荧光的表达含量,并考察百可利对LC3B荧光强度的调节作用。进一步探究不同组别细胞蛋白中自噬上游AMPK、m TOR与自噬过程中ULK表达变化,考察自噬上游过程是否被激活。结果百可利对鱼藤酮损伤后的SH-SY5Y细胞具有保护作用,不仅提高细胞生存率,还抑制LDH过度释放,抑制细胞内α-突触核蛋白寡聚物积聚。在鱼藤酮损伤的SH-SY5Y细胞模型中,自噬标志性蛋白LC3B表达量随损伤时间增加而增加。鱼藤酮损伤24 h时,受损细胞中LC3B表达明显增加,给予百可利的细胞中LC3B含量显著下调。免疫荧光结果也证明鱼藤酮促进LC3B荧光强度增加,而百可利不仅抑制核损伤,还能降低过度增加的荧光含量。同时,鱼藤酮损伤细胞中自噬调节蛋白AMPK/m TOR/ULK均明显上调,而百可利有助于恢复至正常水平。结论百可利通过提高细胞生存率,降低LDH表达,减少α-突触核蛋白毒性发挥神经保护作用。鱼藤酮损伤促进细胞内自噬过程的活化,百可利在抑制细胞凋亡的同时,还通过调控自噬活化发挥神经保护作用,而这种保护作用与对自噬体与溶酶体合成过程的调控有待进一步探究。     

鱼藤酮对小鼠小胶质细胞 BV-2存活率及一氧化氮含量的影响

目的：研究鱼藤酮对小鼠小胶质细胞BV-2存活率及一氧化氮含量的影响。方法 BV-2细胞以5×10^7/L密度接种到细胞培养板中,分别加入鱼藤酮0、1×10^-11、1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6、1×10^-5 mol/L后0、6、12、24、48、72 h等测定细胞存活率。另以1×10^-8 mol/L鱼藤酮干预BV-2细胞48 h,测定上清液中超氧化物歧化酶、过氧化物酶、总巯基、超氧阴离子和NO含量并与未给予鱼藤酮干预的对照组比较。结果5×10^7/L BV-2细胞于0、6、12、24、48、72 h细胞增殖活力分别为0．035±0．001、0．132±0．006、0．334±0．017、1．073±0．044、2．272±0．172、0．776±0．032,可见48 h达到细胞生长曲线的峰值。鱼藤酮（1×10^-6 mol/L ）干预 BV-2细胞24、48、72 h 细胞存活率分别降低至（63．4±10．1）％、（51．7±12．2）％、（33．9±11．2）％;鱼藤酮（1×10^-7 mol/L）干预BV-2细胞72 h细胞存活率降低至（50．8±2．9）％。1×10^-8 mol/L 鱼藤酮干预48 h 后 BV-2细胞上清液一氧化氮水平达（27．6±6．2）μmol/L,明显高于对照组的（13．3±2．5）μmol/L （t＝-2．135, P＝0．044）。结论鱼藤酮在一定浓度范围内可激活小胶质细胞,但是超出此浓度范围时则可能导致小胶质细胞存活率降低。     

5-脂氧酶参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤

目的:以鱼藤酮诱导PC12细胞损伤作为PD细胞模型,观察5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LOX)是否参与细胞损伤。方法:在鱼藤酮处理后不同时间,以MTT方法检测PC12细胞活性变化,以免疫细胞化学方法观察5-LOX核膜移位情况;并观察5-LOX抑制剂齐留通的作用。结果:鱼藤酮(0.3～30μmol/L)可诱导PC12细胞损伤;齐留通(3～100μmol/L)减轻鱼藤酮诱导的细胞损伤。鱼藤酮还时间和浓度依赖性引起5-LOX核膜移位,齐留通(1～30μmo/L)则能抑制5-LOX核膜移位。结论:5-LOX参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤,5-LOX抑制剂齐留通可抑制5-LOX激活,减轻细胞损伤。     

黄芩苷抑制鱼藤酮帕金森病大鼠黑质铁积聚及作用机制

目的研究PD大鼠中脑黑质多巴胺(DA)神经损伤、铁积聚、铁转运蛋白表达及氧应激水平改变之间的关系,探讨铁积聚在PD发生发展中的作用及黄芩苷保护DA能神经、抑制铁积聚的机制。方法实验采用鱼藤酮PD模型大鼠,观察黑质铁含量及TH、DMT1、FP1的表达,检测血清、肝脏铁含量以及大脑皮层GSH和MDA含量。结果鱼藤酮PD大鼠DA能神经元明显缺失,同步发生了脑内氧化应激水平增加、GSH降低;血清铁降低而肝铁增高;黑质铁大量积聚发生在DA能神经元大量脱失和铁转运蛋白DMT1、FP1表达改变之后;黄芩苷可调节DMT1、FP1表达,减少黑质铁积聚,降低脑内氧应激水平,增加GSH含量。结论研究证明铁转运蛋白DMT1表达增加和FP1表达降低参与了黑质铁积聚;铁积聚及过高的氧应激反应促进了黑质DA能神经细胞损伤的发展;黄芩苷对PD大鼠DA能神经细胞具有保护作用,机制与抑制铁积聚、调节铁转运蛋白DMT1、FP1表达、降低氧应激有关。     

低浓度利福平对鱼藤酮介导的帕金森病细胞模型SH-SY5Y细胞的保护作用

目的 探讨低浓度利福平对鱼藤酮诱导的人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)细胞的影响.方法 鱼藤酮损伤SH-SY5Y细胞建立帕金森病细胞模型,光学显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测活性氧(ROS)和细胞凋亡率,RT-PCR法检测α-突触核蛋白mRNA.结果 经利福平1、10、100 nmol/L预处理后,三个利福平组细胞ROS含量、α-突触核蛋白mRNA以及细胞凋亡率均低于鱼藤酮损伤组(P＜0.01).结论 利福平具有抗氧化作用,能降低细胞α-突触核蛋白mRNA水平,并对细胞有保护作用.     

槲皮素抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡

目的: 探讨槲皮素对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡的影响及其作用机制。方法: 运用鱼藤酮诱导损伤PC12细胞,经300 μmol/L槲皮素预处理后,观察细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测Bax和Bcl-2蛋白的表达,JC-1染色检测细胞线粒体膜电位,比较各组的差异。结果: 与鱼藤酮组相比,槲皮素加鱼藤酮处理组细胞形态明显改善,凋亡率降至6.3%(P<0.01),Bcl-2表达增加(P<0.01),Bax表达降低(P<0.01),线粒体膜电位上升(P<0.01)。结论: 槲皮素对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用,上调Bcl-2和下调Bax蛋白的表达,维持线粒体膜电位可能是其作用的机制之一。     

姜黄素对多巴胺能细胞的保护作用研究

目的探讨姜黄素对多巴胺能细胞的保护作用及机制。方法采用神经毒素鱼藤酮(1μmol/L)处理经神经生长因子(NGF)(50 ng/ml×7)诱导分化过的PC12细胞,并在处理前6 h加入1μmol/L的姜黄素进行干预,MTT法检测细胞活力,荧光分光光度法检测细胞内活性氧水平,比色法检测还原型谷胱甘肽(GSH)含量。结果 NGF诱导后的PC12细胞经1μmol/L鱼藤酮处理24 h后,细胞活力下降至对照组的57.1%,细胞内活性氧水平为对照组的189%,而GSH水平显著下降(P<0.05);姜黄素干预后,与鱼藤酮组相比,细胞活力和GSH含量显著提高,活性氧水平显著降低(P<0.05)。结论姜黄素对多巴胺细胞具有保护作用,其机制与抗氧化活性有关。