基于荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中大肠埃希菌数量测定方法开发及比较研究

目的对当归不同炮制品中大肠埃希菌变化进行定量分析。方法建立荧光定量PCR方法,对当归不同炮制品、不同产地、不同收集企业、不同储藏时间的大肠埃希菌进行定量分析。结果不同炮制品中大肠埃希菌数量变化为生当归土炒当归酒当归;在不同产地的当归中以甘肃岷县地区所含的大肠埃希菌的数量最少;与零售企业相比,生产销售企业的当归和酒当归中大肠埃希菌的数量较少;不同储藏时间对当归和酒当归中大肠埃希菌数量有一定影响,随储藏时间的增加,大肠埃希菌的数量也在增加。对部分代表性样品进行平板计数法与荧光定量PCR法比较时发现,平板计数法结果多呈阴性,荧光定量PCR结果均呈阳性。结论所建立的荧光定量PCR法特异性、灵敏度、可靠性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中大肠埃希菌的快速、准确定量检测提供有效手段。     

基于实时荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量测定方法的开发及比较

目的:对当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的变化情况进行定量分析。方法:建立了实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR),对不同产地、不同收集企业、不同储藏时间当归饮片中金黄色葡萄球菌进行定量分析。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL,正向引物、反向引物(10μmol·L~(-1))各0.8μL,模板/基因组DNA 1μL,双蒸水7.4μL。荧光定量反应条件为①扩增曲线:94℃预变性30 s,94℃变性10 s,60℃退火12 s,72℃延伸30 s,循环45次,72℃单点检测信号;②熔解曲线:72℃开始检测,以0.5℃为台阶温度停留15 s采集荧光。根据Real-time PCR的测定结果,分别从生当归、酒当归和土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法测定,并与Real-time PCR检测结果进行比较。结果:不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量排序为生当归土炒当归酒当归;在不同产地的当归饮片中均以甘肃渭源地区样品所含的金黄色葡萄球菌含量为最低;与零售企业相比,生产销售企业的生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量较低;不同储藏时间对生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量有一定的影响,随储藏时间的增加,金黄色葡萄球菌的含量增加。对部分代表性样品进行检测时发现,平板计数法检测结果数量级较Real-time PCR低3～4个数量级。结论:建立的Real-time PCR的特异性、灵敏度、准确性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的快速、准确定量检测提供有效技术手段。     

附子不同炮制品对风湿寒痹类风湿关节炎大鼠的急性毒性试验研究

目的:比较附子不同炮制品对风湿寒痹类风湿关节炎(RA)大鼠的急性毒性。方法:通过高效液相色谱法测定各炮制品水提物中6种酯型生物碱的含量;采用完全弗氏佐剂结合风寒湿因素建立风湿寒痹RA大鼠模型,单次灌胃盐附子水提物(生药量5.81、7.00、8.43、10.16、12.24、14.75 g/kg),通过改良Bliss法计算半数致死量(LD_(50));单次灌胃炮天雄、刨附片、白附片、黑顺片水提物,分别测定最大给药量(MFD),通过观察给药后体重、摄食量、饮水量的变化,计算主要脏器系数,观察HE染色组织病理学变化,检测血生化、血常规指标进行急性毒性评价。结果:黑顺片、盐附子水提物所含双酯型生物碱含量相对较高,炮天雄水提物中单酯型生物碱含量较高。盐附子水提物灌胃RA大鼠的LD_(50)为生药量8.134 g/kg,炮天雄、刨附片、白附片、黑顺片水提物灌胃RA大鼠的MFD分别为生药量28.8 g/kg、46.2 g/kg、46.8 g/kg、63.4 g/kg。与模型对照组比较,8.43 g/kg盐附子组血小板(PLT)含量显著升高(P<0.01);黑顺片63.4 g/kg组总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平和淋巴细胞百分比(LY)明显降低,碱性磷酸酶(AKP)水平、中性粒细胞百分比(GR)、单核细胞百分比(MO)明显升高(P<0.05或P<0.01);刨附片46.2 g/kg组AKP水平明显升高(P<0.05)。结论:盐附子水提物对风湿寒痹RA大鼠的毒性较大,炮天雄、刨附片、白附片、黑顺片水提物对风湿寒痹RA大鼠无明显毒性。     

模糊数学模型在高温耐火棚板制造企业职业病危害风险评估中的应用

  目的  探讨模糊数学模型在高温耐火棚板制造企业职业病危害风险评估中的应用，综合评价用人单位职业病危害等级。
  方法  采用职业卫生调查和职业卫生检测法，对某高温耐火棚板制造企业进行职业病危害因素识别与检测；运用模糊理论构建数学评估模型，对工作场所职业病危害因素暴露状况进行职业病危害风险评估。
  结果  该企业工作场所包括3部分生产区域，分别是原料加工、产品制造、辅助生产，各生产区域最大隶属度数值分别为0.463、0.567和0.910，其职业病危害风险等级分别为Ⅲ（一般）、Ⅱ（良）和Ⅱ（良）。企业整体最大隶属度数值为0.549，整体职业病危害风险等级为Ⅱ（良）。
  结论  模糊数学模型能够应用于高温耐火棚板制造企业职业病危害因素风险等级的评估，为综合评价企业整体和部分职业病危害风险等级提供依据。
     

胡芦巴生品、酒制品抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的有效部位筛选及其酶动力学分析

目的:比较胡芦巴生品和酒制品对α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶抑制活性作用的差别,筛选抑制活性的有效部位,并研究其酶反应动力学。方法:利用萃取法获得胡芦巴生品和酒制品80%甲醇提取物的石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层4个不同极性部位,采用体外α-葡萄糖苷酶抑制模型和α-淀粉酶抑制模型,测定生胡芦巴和酒胡芦巴4个不同极性部位对α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶活性的抑制作用。通过酶促动力学与Lineweaver-Burk曲线推断各有效部位对α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶抑制类型。结果:生胡芦巴和酒胡芦巴只有水层对α-葡萄糖苷酶有抑制作用,酒制品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于生品,生胡芦巴和酒胡芦巴水层萃取物对α-葡萄糖苷酶作用为非竞争可逆。生胡芦巴和酒胡芦巴的乙酸乙酯层和正丁醇层对α-淀粉酶有抑制作用,酒制品的抑制作用优于生品,且均为非竞争可逆。结论:胡芦巴经酒制后可在一定程度上增加对α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶活性的抑制作用,酒胡芦巴水层萃取物有开发成α-葡萄糖苷酶抑制剂的价值,酒胡芦巴的乙酸乙酯和正丁醇提取物具有开发成α-淀粉酶抑制剂的价值。     

牛膝不同炮制品中化学成分的UPLC-Q-TOF/MS分析

目的:比较生牛膝、酒牛膝及盐牛膝的各项质控指标及化学成分的差异。方法:按照2015年版《中国药典》的标准,测定生牛膝、酒牛膝及盐牛膝的水分、总灰分和醇溶性浸出物含量,考察指标成分含量测定方法的线性范围、精密度、稳定性、重复性及加样回收率,建立UPLC-Q-TOF/MS比较牛膝不同炮制品中主要化学成分相对含量的差异。结果:生牛膝、酒牛膝及盐牛膝的水分、总灰分及醇溶性浸出物的含量均符合2015年版《中国药典》的要求,运用高分辨质谱鉴定了10个主要化学成分,分别为苄基葡萄糖苷,苄基葡萄糖苷异构体,牛膝甾酮A,水龙骨素B,β-蜕皮甾酮,牛膝甾酮,姜状三七苷R_1,人参皂苷Ro,牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ。牛膝经酒炙后苄基葡萄糖苷,苄基葡萄糖苷异构体,水龙骨素B,β-蜕皮甾酮和人参皂苷Ro的含量显著升高,而姜状三七苷R_1,牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ的含量则显著减低;盐炙后苄基葡萄糖苷,苄基葡萄糖苷异构体,牛膝甾酮A,水龙骨素B,β-蜕皮甾酮和牛膝甾酮含量显著升高,而姜状三七苷R_1,人参皂苷Ro,牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ的含量则显著降低。结论:牛膝炮制后酚苷类和甾体皂苷类成分的含量显著上升,而三萜皂苷类成分的含量则显著降低。     

高乌头炮制前后毒性部位与镇痛抗炎药效部位筛选研究

目的:筛选高乌头炮制前后毒性及药效部位,探讨毒性与药效的关系,为高乌头减毒存效合理炮制提供科学依据。方法:采用小鼠急性毒性实验比较不同溶剂萃取部分的毒性,筛选生、制高乌头的毒性部位,以热板法、扭体法及二甲苯致鼠耳肿胀实验考察不同剂量生、制高乌头毒性部分对小鼠的镇痛抗炎作用;筛选药效部位,探究毒性部位是否为药效部位。结果:生、制高乌头均为三氯甲烷部分的毒性最强,水提及正丁醇部分次之,生品LD50分别为0.09、1.81、24.41 g/kg,制品LD50分别为0.11、2.42、0.87 g/kg;而石油醚、乙酸乙酯及乙醇部分毒性均最小,生品最大给药量分别为2.69、3.11、28.38 g/kg,制品最大给药量分别为13.12、1.98、20.32 g/kg。给药后120 min、1.5、4.5 mg/kg的生品三氯甲烷部分与4.5 mg/kg的制品三氯甲烷部分均能提高小鼠热板痛阈值,且呈量效关系,镇痛作用优于1.6 mg/kg氢溴酸高乌甲素组。注射冰醋酸15~30 min,1.5、4.5 mg/kg的生、制品三氯甲烷部分均能有效抑制冰醋酸所致小鼠的扭体次数,且呈量效关系,抑制率略低于1.6 mg/kg氢溴酸高乌甲素组。在二甲苯致鼠耳肿胀实验中,1.5、4.5 mg/kg的生、制高乌头三氯甲烷部分均能有效缓解小鼠耳肿胀度,且呈量效关系,肿胀抑制率略低于10.0 mg/kg消炎痛组。结论:三氯甲烷部分既是生、制高乌头的毒性部位,又是其镇痛抗炎的主要药效部位,且呈量效关系,推测其镇痛抗炎活性与毒性存在一定的关联。     

半夏及其炮制品7种主要核苷类成分差异性分析

目的:核苷类成分是半夏的主要药效物质,通过比较半夏及其炮制品中主要核苷类成分含量的差异,为科学评价及有效控制半夏及其炮制品质量提供参考。方法:采用HPLC结合多变量统计分析,对半夏及其炮制品的主要核苷类成分进行含量测定,并筛选出炮制前后的差异性成分。结果:测定结果表明,生半夏中各核苷类化合物含量显著高于炮制品;法半夏中鸟苷、腺苷平均含量显著高于姜半夏(P<0.05),与清半夏各成分平均含量差异不显著;姜半夏和清半夏未见明显区分。主成分分析(PCA)结果显示生半夏及其炮制品可被明显区分;正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选得到生半夏与法半夏的差异性成分为尿苷、胸苷;生半夏与姜半夏的差异性成分为尿苷、鸟苷、腺苷、胸苷;生半夏与清半夏的差异性成分为尿嘧啶、尿苷、鸟苷、腺苷、胸苷;法半夏与姜半夏、法半夏与清半夏的差异性成分均为尿嘧啶、鸟苷、腺苷;姜半夏与清半夏未见明显区分。以上结果表明核苷类成分含量可体现半夏及其炮制品之间的差异。结论:该实验建立的含量测定方法科学、准确、稳定且易于操作,为半夏及其炮制品的质量控制提供了参考依据。     

枳壳不同炮制品的燥性比较及其对功能性消化不良大鼠胃肠功能的影响

目的:比较枳壳不同炮制品的燥性,考察其对功能性消化不良(FD)大鼠胃肠功能的影响。方法:以大鼠饮水量、排尿量、肾水通道蛋白3(AQP3)含量、血清环磷酸腺苷(c AMP)与血清环磷酸鸟苷(c GMP)比值为评价指标,观察不同剂量的枳壳生品、麸炒枳壳、蜜麸枳壳对健康大鼠水液代谢的影响;以胃黏膜损伤指数,血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素6(IL-6),IL-8含量为评价指标,观察不同剂量枳壳生品、麸炒枳壳、蜜麸枳壳对健康大鼠胃黏膜损伤的影响;以大鼠胃残留率和小肠推进率,血清胃动素(MTL),血管活性肠肽(VIP),降钙素基因相关肽(CGRP)含量为评价指标,观察不同剂量枳壳生品、麸炒枳壳、蜜麸枳壳对FD大鼠胃肠功能的影响。结果:在水液代谢方面,同等剂量给药组与空白组相比,差异性排序为枳壳生品麸炒枳壳蜜麸枳壳,且高剂量组低剂量组;在胃黏膜损伤方面,不同剂量枳壳生品、麸炒枳壳、蜜麸枳壳组各项指标与空白组比较均无显著性差异;在促胃肠动力方面,同等剂量给药组与模型组相比,差异性为麸炒枳壳枳壳生品蜜麸枳壳,且低剂量组高剂量组。结论:枳壳生品的燥性主要表现为对机体津液的损伤,且强度与剂量有关,对健康大鼠胃黏膜未见明显直接刺激。炮制后可在一定程度上缓和伤津之弊,且以蜜麸枳壳缓和作用最佳;枳壳生品和炮制品均可促进FD大鼠胃肠功能的恢复,麸炒枳壳治疗作用优于生品与蜜麸制品。