登革病毒悬液芯片分型检测方法的建立

目的 建立一种基于悬液芯片的登革病毒(dengue virus,DV)检测方法,可对四种血清型登革病毒进行快速检测和鉴定.方法 依据GenBank上4种病毒的基因序列信息,设计并合成相关引物及探针序列.抽提病毒RNA,经反转录后对目的基因进行PCR扩增,产物与核酸探针微球组杂交后于Bio-PlexTM 200系统检测荧光信号值.结果 DV1的悬液芯片检测敏感性约9 DNA拷贝,DV2、DV3、DV4的悬液芯片检测敏感性约90 DNA拷贝.进而将本方法用于检测15份临床标本,其检测结果与分型荧光RT-PCR一致.结论 建立了可同时检测四种血清型登革病毒的悬液芯片检测方法,为快速筛查和鉴定登革病毒提供了新的手段.     

登革2型病毒NS3蛋白具有抑制病毒复制的作用

目的 构建登革2型病毒非结构蛋白NS3及其结构域基因的真核表达载体,并鉴定重组蛋白在BHK-21细胞内对登革病毒复制的抑制作用.方法 以登革2型病毒新几内亚毒株（NGC DENV-2）基因组RNA为模板,设计引物扩增获得编码NS3及其蛋白酶NS3P和解旋酶NS3H的基因,通过基因重组的方法分别将3段基因片段克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,获得重组表达载体pcDNA3.1-NS3、pcDNA3.1-NS3P和pcDNA3.1-NS3H;经脂质体法分别转染BHK-21细胞后,用RT-PCR、间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达的蛋白.结果 成功构建pcNS3、pcNS3P和pcNS3H重组质粒,转染进BHK-21细胞48 h后,分别检测出相对分子量约为69 kDa、50 kDa及18 kDa的特异蛋白;且转染pcNS3、pcNS3H组均与空白对照组及未转染组间的病毒载量存在着差异（P＜0.05）;转染pcNS3P组与未转染组及空白对照组的病毒载量无统计学差异（P＞0.05）.结论 DENV-2的非结构蛋白NS3能够抑制病毒的复制.     

广州地区2012年1、2型登革病毒基因型特征研究

目的测定广州市2012年1、2型登革病毒（DENV1、DENV2）的E基因序列，探讨其来源及基因型。方法收集广州市2012年478例登革热患者急性期血清478份，用C6／36细胞培养分离登革病毒，RT—PCR法扩增全长E基因，测定序列并绘制系统发育树，结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果478例患者标本中分离到DENV16株，DENV22株，测序获得E基因序列，E基因长度均为1485bp，编码495个氨基酸，DENV1碱基同源性为97．4％～99．9％，推导的氨基酸同源性为99．2％～100．0％，其同源性与2011、2006和2004年份的国内DENV1流行株接近。DENV2碱基同源性为91．3％，推导的氨基酸同源性为97．8％，其同源性与我国DENV2流行株相对较远。进化分析发现，DENV1均属于同一亚型，即亚洲型，DENV2属于两个亚型，即马来西亚／印度次大陆和东南亚型。结论推测广州市2012年DENV1和DENV2均为输入性，DENV1可能由柬埔寨和广东佛山输入，DENV2可能由孟加拉国和缅甸输入。     

深圳市福田区2014年登革热疫情流行病学特征分析

目的 分析2014年深圳市福田区登革热疫情流行病学特征,探讨预防控制措施.方法 对各医院报告的福田区病例进行流行病学个案调查,采集病例血液样本开展血清学或病原学检测,并划定疫点进行蚊媒调查和病例搜索.结果 深圳市福田区2014年报告登革热病例87例,发病率6.52/10万,无死亡病例;发病高峰出现在10月份,当月气温徘徊在25～30℃,适宜白纹伊蚊生长;男女性别比为1:0.47;发病年龄最小13岁,最大67岁,以青壮年为主.全区有2个暴发点,病毒型别主要为登革热Ⅰ型.疫情发生时布雷图指数最高达140.结论 深圳市福田区存在登革热流行的基本条件,疫情存在着明显的季节性、人群对登革热普遍易感等特征.有效控制疾病传播媒介白纹伊蚊是控制疫情的根本措施,疫情的早发现早报告也是有效控制措施之一.     

Th细胞及其细胞因子与登革病毒致病机制关系的研究进展

近年来 ,登革病毒所致疾病病例不断增加 ,虽有诸多学者致力于对其致病机制的研究 ,但至今仍未完全明了。Th细胞亚群及其细胞因子与登革病毒所致疾病的重要关系引起许多学者的兴趣 ,本文试就近年来这方面的研究进展作一综述     

应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。     

登革病毒甲基纤维素微量蚀斑技术的建立

目的建立登革病毒甲基纤维素微量蚀斑技术。方法将4株登革病毒接种于C6/36细胞内,5-7d后染色,观察蚀斑情况并计数。将测得值与组织培养半数感染量测定结果比较。结果登革病毒甲基纤维素微量蚀斑技术重复性好,比组织培养半数感染量法敏感。结论甲基纤维素徽量蚀斑技术可靠易行,可用于登革病毒滴定。     

免疫荧光技术检测室内感染蚊虫体内登革病毒的研究

目的　探讨检测媒介蚊虫体内登革病毒的方法。　方法　以埃及伊蚊和白纹伊蚊两种有效媒介为研究对象 ,在人工经口感染大剂量登革 2型病毒 (DEN- 2 )的基础上 ,通过蚊细胞培养病毒分离和蚊头部压片免疫荧光技术进行病毒抗原检测。　结果　埃及伊蚊感染 DEN- 2病毒 1d后 ,接种 C6 / 36细胞 ,盲传一代后第 5 d出现空斑现象 ,确证细胞发病。白纹伊蚊经口感染登革病毒后 ,取吸血雌蚊每日进行头部压片免疫荧光检测 ,结果显示 ,从蚊虫感染后第 1d～第 2 0d内均能检测到病毒抗原。　结论　用免疫荧光技术 ,可直接检测出感染蚊体内是否携带登革病毒 ,是较为简便、省时、敏感的方法     

天然罗汉松二萜体外抗登革病毒活性研究

登革病毒(dengue virus,DENV)是造成热带和亚热带地区登革热和登革出血热季节性大爆发的蚊媒病原体,可导致严重威胁生命的疾病,因此亟需研发DENV疫苗和药物。本研究发现从石栗枝叶中分离的罗汉松型二萜(3α,5β,10α)-13-methoxypodocarpa-8,11,13-triene-3,12-diol(MPTD)具有很强的体外抗DENV作用。噬斑抑制实验检测MPTD对4种不同血清型DENV的抑制作用;MTT实验检测其对Vero和Huh7两种细胞的毒性;qRT-PCR和Western blot实验分别在RNA和蛋白水平检测其抗DENV的活性。结果表明,MPTD处理可显著降低DENV感染Vero细胞的病毒滴度,其对4种DENV(1~4)的半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)值分别为2.72±0.39、10.99±5.18、18.72±0.21和0.48±0.28μmol·L^-1。MPTD显著抑制DENV RNA的合成和E蛋白的表达,其可能抑制DENV复制的前期阶段而发挥抗病毒活性。进一步的研究显示,MPTD对DENV感染的抑制作用不是靶向病毒进入细胞阶段。MPTD对DENV具有显著抑制作用,是一种有潜在应用价值的抗DENV化合物。     

登革病毒prM蛋白糖基化对ADE的影响

【立论依据及设计思路】 登革病毒的致病作用表现复杂,目前大多数学者均认同Halstead等于1977年提出的抗体依赖增强效应(ADE)学说。现已知与机体免疫应答有关的病毒蛋白包括E蛋白、M蛋白和NS1蛋白。其中,prM蛋白(即M蛋白的前体)的切割是未成熟登革病毒颗粒向成熟病毒颗粒转变的关键步骤。且prM蛋白为黄病毒属的主要表面抗原,能诱导机体产生特异性抗体,研究发现其亦与ADE作用相关。同行及我们的研究均发现 prM抗体是诱导ADE作用发生的主要增强型抗体。prM蛋白本身为糖蛋白,其糖基化位点存在于7、31、52上。目前对于prM蛋白各位点的糖基化作用及其机制不明,特别是其对ADE作用的影响尚无报道。因此,本实验通过构建单个和多个糖基化位点突变的真核表达载体,制备突变后prM抗体,探讨登革病毒prM蛋白N-糖基化位点7、31、52的单个和多个位点的突变重组对其ADE效应的影响。 【实验内容】 通过聚合酶链式反应(PCR)、突变体的设计与构建技术构建重组真核表达载体pPICZαA-prM,通过毕赤酵母表达系统稳定表达并纯化蛋白,免疫小鼠,制备鼠多克隆抗体。用分析型流式细胞仪和荧光定量PCR两种方法检测ADE效应。 【材料】 酵母表达质粒pPICZαA;菌株P. pastoris x33;实验小鼠;C6/36细胞株;LoVo 细胞株。 【可行性】 预期结果:(1)prM蛋白的各位点的糖基化都将对病毒的ADE效应有所影响,且糖基化位点越多,对ADE效应影响越大。(2)prM蛋白部分位点的糖基化将对病毒的ADE效应有所影响,且不同位点影响不同。(3)prM蛋白3个位点的糖基化对病毒的ADE效应都没有影响。 【创新性】 登革病毒是广泛流行于热带亚热带危害较大的虫媒病毒。人们对登革出血热和登革休克综合征机制未明确。其次,从蛋白糖基化角度研究探讨prM蛋白参与ADE效应的可能机制尚未见报道。本研究项目有助于进一步探讨DHF/DSS的发生机制,并能为新型登革热病毒疫苗与药物的研发提供新方向或者新思路。