大肠埃希菌肠毒素B亚基对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响

目的 研究大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基（LTB）对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响。 方法 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-SAG1-ROP2和pEASY-E1-LTB。BALB/c小鼠88只，随机均分为4组，分别用PBS（A组）、 pcDNA3.1空质粒（B组）、 pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒（C组），以及pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒和pEASY?-E1-LTB质粒（D组）进行滴鼻免疫，每种质粒20 μg/（只·次）。每组小鼠随机抽取15只，每周免疫1次，共4次，末次免疫后2周，测定其血清IgG和IgA抗体水平，气管和小肠黏膜冲洗液分泌型IgA（sIgA）水平，以及脾细胞培养上清中γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）水平；每组中余7只小鼠，每周免疫1次，共3次，末次免疫后4周，弓形虫速殖子腹腔接种感染（1×103/鼠），观察比较各组生存时间。 结果 成功构建pEASY-E1-LTB重组表达质粒。D组小鼠血清IgG(0.626±0.100)和IgA抗体水平(1.086±0.138)，气管和小肠黏膜冲洗液sIgA水平(0.886±0.164)，以及细胞因子IFN-γ[(2 017±266)pg/ml]和IL-4水平[(203±31)pg/ml]均显著高于其他各组（均P<0.05）。感染弓形虫速殖子后，A、B、C和D组小鼠的生存时间中位数分别为3、4、6和10 d，D组的生存时间长于其他各组（均P<0.05）。 结论 LTB能明显增强弓形虫速殖子SAG1?鄄ROP2复合基因的免疫效果。     

新型粘膜免疫佐剂候选株LTAˉB+的构建

目的 :产肠毒素大肠杆菌产生的不耐热肠毒素 (LT)不仅是很强的口服免疫原 ,而且其粘膜免疫佐剂作用显著。LT的毒性限制了它的直接使用 ,希望通过体外定点诱变技术 ,获得具有粘膜免疫佐剂作用的LT减毒株。方法 :以人源LT基因为研究对象 ,首先构建了重组质粒 pUC19 LT ,然后用单引物PCR法和重叠延伸PCR法分别构建了LTQ7和K63基因突变体。结果 :CHO细胞体外试验和家兔肠结扎体内试验毒性测定的结果表明 ,LT突变体K63的毒性明显降低。结论 :K63有希望成为候选的高效粘膜免疫佐剂。     

酶联免疫吸附试验检测产不耐热肠毒素大肠杆菌的研究

本文报道了ELISA法检测产不耐热肠毒素大肠杆菌(ETEC/LT⁺)的研究。用酶标抗-CT建立的ELISA,检测杭州市医院病人分离的70株和动物分离的56株大肠杆菌,以及来源于腹泻患者的10株沙门氏菌、亲水气单胞菌、类志贺氏邻单胞菌和耶尔森氏菌,结果仅从病人菌株中检出3株ETEC/LT₊,阳性率为4.3%;未发现与其它4种肠道病原菌有交叉反应。这是一种特异、敏感、快速检测ET EC的方法,在感染性腹泻的病原研究中有推广应用价值。     

内置式佐剂LTB对空肠弯曲菌重组蛋白疫苗免疫增强作用的研究

目的 构建空肠弯曲菌(CJ)外膜蛋白(PEB1)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其免疫原性.方法 应用重组PCR技术将PEB1和LTB序列连接,构建PEB1-LTB融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS- PAGE电泳表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.肌注方式免疫小鼠,末次免疫2周后,测定小鼠血清中IgG、IgA及黏膜冲洗液中sIgA抗体水平.结果 PCR扩增分别获得约787、372 bp产物,二者融合后获得一约1180 bp目的基因；该重组蛋白可具有良好的免疫原性,肌注小鼠后其血清IgG、IgA及黏膜冲洗液中sIgA含量均显著增高(P ＜0.01).结论 构建PEB1-LTB融合蛋白可有效增强小鼠免疫应答水平.     

粘膜免疫佐剂：肠产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)研究进展

粘膜免疫佐剂活性是肠产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的重要生物学特性之一。除野生型LT外，LT突变体如LTE112K、LTG33D等及重组体rLTB均具有很强的粘膜免疫佐剂活性；同时后者具有毒性较低的特点，显示了良好的临床应用研究前景。本文对LTs作为粘膜免疫佐剂的作用机制及应用研究近况作了简要的回顾。     

用多聚酶链反应检测LT-大肠杆菌

本文报告用多聚酶链反应检测产生不耐热肠毒素大肠杆菌,使用二个寡核苷酸引物,直接从麦康凯平板的菌落中对该毒素的 A 亚基一段高度保守区域的 DNA 进行扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测,30株细菌只有产生不耐热肠毒素大肠杆菌检测结果为阳性,其它细菌均为阴性.此法简便、特异、敏感.     

应用siRNA技术抑制产肠毒素大肠杆菌LT基因表达的研究

目的应用小干扰RNA(siRNA)技术抑制产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因的表达。方法针对LT基因设计siRNAs序列,在ETEC培养过程中,将针对LT的siRNA、非特异性对照siRNA、阴性对照siRNA和LB培养基分别加入siRNA组(siRNA-LT1组、siRNA-LT2组)、siRNA-coa3组、siRNA-NC组和空白对照组,分3个时间点加入,每次1nmol。在首次加入siRNA后45min(A时间点)、90min(B时间点)、135min(C时间点)留取菌液,应用实时荧光定量PCR检测上述3个时间点5组LT mRNA的表达水平。应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测siRNA-LT1组、siRNA-LT2组和空白对照组在3个时间点的LT蛋白表达水平。结果实时荧光定量PCR结果显示,siRNA-LT1在A、B、C 3个时间点对LT mRNA表达的抑制率分别为70.9%、70.1%、72.5%,siRNA-LT2在A、B、C 3个时间点对LT mRNA表达的抑制率分别为70.1%、69.2%、70.5%,siRNALT1组、siRNA-LT2组对LT mRNA表达的抑制率与相应处理时间的siRNA-NC组、siRNA-coa3组、空白对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果显示,siRNA-LT1和siRNA-LT2在A、B、C 3个时间点对LT蛋白表达的抑制率分别为43.1%、18.4%、5.0%和38.2%、15.4%、30.1%。结论针对LT基因设计合成的siRNA在体外能有效地抑制LT基因的表达。     

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)无毒突变体mLT63在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的 在大肠杆菌中表达并纯化大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63融合蛋白，并探索其免疫反应性。方法采用不同的诱导温度，IPTG浓度，葡萄糖含量，pH值以及不同的培养基优化重组菌TB1（pMAL-c2X-mlt）的表达条件，表达产物经超声粉碎,超声上清经初步盐析、应用直链淀粉亲和层析柱纯化，Western blot鉴定纯化产物的免疫学反应性。结果 融合蛋白在诱导表达产物中的含量达到16．11％,纯化产物的纯度达到72．58％。纯化产物能够被抗CT血清所识别。结论 成功表达并纯化出了大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63，获得了纯度较高并具有良好免疫反应性的融合蛋白。     

大肠杆菌不耐热肠毒素的免疫学机制研究进展

随着免疫学及疫苗研究的不断发展,大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT)在免疫过程中的作用日益受到人们重视.本文介绍了LT的免疫学机制与应用方面的进展.     

大肠杆菌不耐热肠毒素基因克隆和无毒突变体mLT63的构建及序列分析

目的:大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是很强的免疫原,也具有很强的粘膜免疫佐剂作用,但LT的毒性限制了它在人类疫苗中使用。本研究希望通过定点诱变构建无毒或减毒并保持LT免疫学特性的突变体。方法:以人源肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌株E.coli44815为研究对象,应用本研究室改进的SDS裂解法小量制备含LT基因的野生大质粒,PCR扩增LT基因,构建重组质粒pNEB193_elt;采用重叠延伸法PCR对LT第63位氨基酸进行体外定点诱变,构建LT突变基因的重组克隆载体,测序并进行序列分析鉴定。结果:采用本研究室改进的SDS裂解法,可成功地小量提取满足扩增模板要求的大质粒;所克隆的LT基因与GenBank公布的一致;定点诱变正确,无非特异性突变。结论:克隆的LT野生基因和定点诱变基因可用于构建重组表达载体,表达重组蛋白,对其粘膜免疫佐剂性或其他相关特性进一步研究。