重组腺病毒载体mIL-12治疗小鼠黑色素瘤的实验研究

目的： 观察重组腺病毒载体AdmIL-12对小鼠黑色素瘤的治疗效应.方法： 皮下注射B16黑色素瘤细胞给C57BL/6小鼠建立荷瘤模型.于瘤内注射重组腺病毒载体AdmIL-12治疗, 观察皮下肿瘤的生长及荷瘤小鼠的存活期.采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测荷瘤小鼠脾细胞的杀伤活性.结果： 重组腺病毒载体AdmIL-12治疗后, 能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长, 明显延长荷瘤小鼠的存活时间, 增强荷瘤小鼠脾细胞的杀伤活性.结论： 重组腺病毒载体AdmIL-12对小鼠黑色素瘤有显著的治疗效应.     

问号钩端螺旋体属lipL32/1-ompL1/1融合基因的真核表达及其表达产物的免疫反应性

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)的融合基因lipL32/1-ompL1/1真核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性.方法:采用连接引物PCR构建融合基因lipL32/1-ompL1/1,克隆测序后构建lipL32/1-ompL1/1的毕赤酵母真核表达系统pPIC9K-lipL32/1-ompL1/1-P.pastorisGS115.用MM和MD平板分离His Mut 型菌落,YPD平板筛选出G418高抗性的His Mut 转化子.以酵母裂解酶处理的高拷贝转化子His Mut 克隆裂解产物为模板,5'AOX1和3'AOX1为引物,用PCR检测所构建的毕赤酵母工程菌株染色体DNA中的目的融合基因.在BMMY培养基中用甲醇诱导目的重组蛋白rLipL32/1-rOmpL1/1表达.采用硫酸铵沉淀,Ni-NTA亲和层析提纯培养物上清液中的rLipL32/1-rOmpL1/1.采用SDS-PAGE和Western blot分别检测rLipL32/1-rOmpL1/1的产量及其免疫反应性.结果:获得的lipL32/1-ompL1/1融合基因约为1 794 bp.其核苷酸和氨基酸序列与原始lipL32/1和ompL1/1基因型比较,相似性分别高达99.94%和100%.所构建的真核表达系统可分泌rLipL32/1-rOmpL1/1,SDS-PAGE后位于预期位置处,产量约占上清总蛋白的40%.rLipL32/1和rOmpL1/1兔抗血清均能与表达的rLipL32/1-rOmpL1/1结合.结论:本研究成功地构建了钩体lipL32/1-ompL1/1融合基因高效毕赤酵母真核表达系统,所表达的融合蛋白具有特异的免疫反应性,可作为研制钩体新疫苗的候选抗原.     

问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测

目的构建LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用，了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法采用常规分子生物学技术构建LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rLTB-LipL32／1及rCTB-LipL32／1表达情况。分别采用Western blot和GM1-ELISA检测rLTB-LipL32／1及rCTB—LipL32／1的免疫反应性和佐剂活性。采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况。采用ELISA检测228例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体。采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用。结果与报道的相关序列比较，LTB—LipL32／1和CTB-LipL32／1融合基因核苷酸序列相似性分别为99．12％～99．71％和98．54％～99．42％，氨基酸序列相似性分别为97．58％-99．63％和96．77％～99．63％。rLTB-LipL32／1和rCTB—LipL32／1表达产量均约为细菌总蛋白的10％，并主要以包涵体形式存在。rLTB—LipL32／1和rCTB-LipL32／1均分别能与LipL32／1兔抗血清和牛GMI结合。97．9％(95／97)问号钩体野生株含有LipL32基因，95．9％(93／97)问号钩体野生株与rLipL32／1和rLipL32／2兔抗血清的MAT结果阳性。97．4％(222／228)和94．7％(216／228)的病人血清rLipL32／1和rLipL32／2抗体阳性。rLTB-LipL32／1、rCTB-LipL32／1和rLipL32／1豚鼠保护率分别为75．0％、75．0％～87．5％、50．O％～62．5％。结论成功构建了LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因及其原核表达系统。rLTB-LipL32／1和rCTB-LipL32／1融合蛋白有良好的抗原性和佐剂活性及一定的免疫保护作用，具有成为问号钩体属特异性疫苗的良好前景。LipL32／1是不同问号钩体血清群中广泛存在、序列保守、高频率表达的基因。     

rLTB/rCTB-rOmpL1/1融合基因及其原核表达系统的构建和鉴定

目的:构建ltB/ctB-ompL1/1融合基因及其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性,检测问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株ompL1基因的携带和表达情况及钩体患者血清特异性抗体水平.方法:采用连接引物PCR构建ltB-ompL1/1和ctB-ompL1/1融合基因,常规方法构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE、Western blot和GM1-ELISA分别检测目的重组蛋白rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1表达量、免疫反应性及与GM1结合的活性.采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株ompL1基因及其表达情况.采用ELISA检测228例钩体患者血清ompL1基因产物的抗体.结果:与报道的相关序列比较,ltB-ompL1/1和ctB-ompL1/1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性,分别为99.7%～99.9%和99.5%～100%.rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1表达产量均约为细菌总蛋白的10%,主要以包涵体形式存在.rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1均分别能与rOmpL1/1兔抗血清和牛GM1结合.89.7%问号钩体野生株含有ompL1基因,87.6%问号钩体野生株分别与rOmpL1/1和rOmpL1/2兔抗血清出现效价,为1:4～1:256的MAT阳性结果.86.8%和88.6%的患者血清标本rOmpL1/1和rOmpL1/2抗体阳性.结论:rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1融合蛋白有良好的免疫原性及与GM1结合的活性.不同问号钩体血清群中广泛存在ompL1基因并高频率表达,不同基因型表达产物有广泛的交叉抗原性.     

甲型副伤寒杆菌侵袭蛋白(spaO)基因原核表达及免疫性和保护作用研究

目的研究甲型副伤寒杆菌spaO基因重组表达产物rSpaO免疫性和保护作用,并了解甲型副伤寒杆菌临床菌株spaO基因携带和表达情况.方法扩增并克隆甲型副伤寒杆菌临床株JH01 spaO基因,构建原核表达系统;采用SDS-PAGE分析rSpaO表达情况,Ni-NTA亲和层析法收集rSpaO,采用Western blot鉴定其免疫反应性;采用PCR和ELISA检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株spaO基因携带和表达频率;观察rSpaO对甲型副伤寒杆菌50001株感染小鼠的免疫保护作用.结果与报道的相关序列比较,克隆的spaO基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.45%～99.89%和99.01%～100%;rSpaO表达量为细菌总蛋白的75%左右;甲型副伤寒杆菌全菌抗血清能识别rSpaO;rSpaO免疫家兔可产生抗体;94.9%（93/98）甲型副伤寒杆菌临床菌株含有spaO基因,91.4%（85/93）spaO＋菌株表达SpaO.rSpaO灌喂或皮下注射免疫小鼠（500μg）受甲型副伤寒杆菌50001株攻击后的存活率分别为58.3%和50.0%;若加入5μgrLTB,存活率分别上升88.3%和75.0%.结论甲型副伤寒杆菌临床菌株有较高的spaO基因携带率和表达率;rSpaO有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗的候选抗原.     

牙龈卟啉单胞菌prtC基因原核表达系统构建及牙周损伤与局部 PrtC水平的关系(英文)

目的构建牙龈卟啉单胞菌胶原酶基因prtC原核表达系统并鉴定其表达产物的抗原性和免疫反应性,确定牙周损伤与其局部PrtC水平之间的关系。方法采用高保真PCR从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277和47A1株扩增出全长prtC基因片段,TA克隆后测序。采用pET32a质粒和大肠杆菌BL21DE3株构建prtC基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rPrtC的表达。采用Westernblot检测rPrtC的抗原性和免疫反应性。建立ELISA,检测人慢性牙周炎龈下菌斑标本中的PrtC水平。结果牙龈卟啉单胞菌ATCC33277和47A1株prtC基因核苷酸序列完全相同。与报道的相应序列比较,克隆的prtC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.46%和99.07%。在不同浓度的IPTG诱导下,rPrtC的产量高达细菌总蛋白的50%左右。rPrtC能与牙龈卟啉单胞菌全菌抗体结合,并能有效地诱导家兔产生特异性抗体。91.39%的人慢性牙周炎龈下菌斑标本中可检出PrtC,重度牙周炎标本中PrtC水平明显高于轻度牙周炎(P<0.05)。结论本研究成功地构建了牙龈卟啉单胞菌prtC基因高效原核表达系统。rPrtC具有良好的抗原性和免疫反应性,可作为研制牙龈卟啉单胞菌疫苗和血清学检测试剂盒的候选抗原。人慢性牙周炎的牙周破坏程度与局部PrtC水平密切相关。     

问号钩端螺旋体主要外膜蛋白免疫功能表位及其致炎作用的研究

目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)主要外膜蛋白OmpL1、LipL32和LipL41免疫功能表位及其致炎作用.方法:建立Ni-NTA亲和层析法,提取不同基因型表达的目的重组蛋白rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2.采用SDS-PAGE检测上述目的重组蛋白的表达情况和提取物纯度.分别采用Signal P3.0预测服务器Signal P-NN软件、Propred MHC class-Ⅱ binding peptide prediction-ProPred预测服务器EMBOSS软件,对上述蛋白的信号肽、MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位进行分析.以人脐静脉内皮细胞株EVC-304为效应细胞,采用ELISA检测上述目的重组蛋白诱导人脐静脉内皮细胞EVC-304分泌IL-1、IL-8和TNF-α的作用.结果:在IPTG诱导下,所构建的原核表达系统可有效表达rOmpL1/1和rOmpL1/2、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2,其产量分别约占细菌总蛋白的30%和15%、40%和35%、15%和10%.提纯后的目的重组蛋白SDS-PAGE后均仅见单一的蛋白条带.OmpL1s、LipL32/1和LipL32/2、LipL41s的信号肽分别位于N端1-24、1-21和1-24、1-24位氨基酸残基.OmpL1s、LipL32s和LipL41s分别有2、2和1个相同的主要MHC-Ⅱ结合肽和B细胞表位,其中OmpL1/2另有1个主要MHC-Ⅱ等位基因结合肽和B细胞表位(59-78).不同浓度的OmpL1s、LipL32s和LipL41s均可明显促进人静脉内皮细胞株EVC-304合成并分泌IL-1α、IL-8和TNF-α(P<0.05).其中IL-1α水平以作用24 h时最高,然后下降;IL-8和TNF-α水平则作用48 h高于24 h.结论:问号钩体ompL1/1、lipL32或lipL41不同基因型的表达产物均存在相似的MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位.rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2对EVC-304细胞均有直接的致炎作用.