多重PCR 系统的建立及其在社区型甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌中PVL噬菌体分型中的应用

 目的从基因组型和表型两方面解析从医院环境中分离出的社区型甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌（MRSA）,对携带杀白细胞素（ PVL）基因的MRSA 中的PVL 溶原噬菌体进行分型。方法聚合酶链式反应（PCR）解析菌株所携带的SCC_mec 基因岛型及PVL毒素基因;凝固酶试验测定菌株的凝固酶型;设计8 组PCR 反应组合检测PVL溶原噬菌体型。结果36株菌株所携带的SCC_mec 基因岛分型多样化。携带郁c 型SCCmec 的菌株占多数,为16 株（44.4%）,其次为携带域型SCC_mec 的菌株,为10 株（27.8%）。各菌株所携带的SCC_mec 型别与菌株的凝固酶分型高度一致。经多重PCR 检测,6 株PLV阳性菌株所携带的PVL 噬菌体型分别为ψ108PVL型（3 株）,_ψ 2958PVL 型（1株）和_ψ Sa2mw 型（2 株）。结论院内分离的社区型MRSA的基因型和表型多样化,PVL噬菌体分型的多重PCR系统具有可应用性,应用此系统对鉴别具有异构六角形头部和伸长形头部的PVL 溶原噬菌体有意义。     

异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌检测方法的临床应用评价

近年来,随着甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染率的上升和万古霉素的广泛使用,临床上出现了万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌,包括万古霉素中介金黄色葡萄球菌(vancomycinintermediate Staphylococcus aureus,VISA)和异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌(heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus,hVISA).2006年,美国临床和实验室标准协会(CLSI,原NCCLS)将万古霉素对金黄色葡萄球菌的折点进行了更新,但并未对hVISA做出明确的定义,也未推荐确认hVISA的标准方法[1].目前,hVISA的准确检测仍存在困难,其分离率和临床意义尚不明确.为此,本研究对国际上常用的3种检测方法进行比较分析,并评价它们的可靠性和临床应用价值,旨在寻找一种适用于临床实验室检测hVISA的简便易行的方法.     

ccr重组酶基因介导SCCmec基因岛的剪切功能研究

目的 构建携带ccrC和ccrAB重组酶基因的载体质粒,并导入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中,验证ccrC重组酶具有把Ⅴ型SCCmec基因岛从细菌染色体上特异性剪切下来的功能.方法 以携带Ⅴ型SCCmee基因岛的菌株81/0342的染色体DNA为模板,应用PCR法扩增ccrC基因,再以携带Ⅱ型SCCmec基因岛的菌株N315的染色体DNA为模板,应用PCR法扩增ccrAB基因,分别克隆到温度敏感质粒pYT3上构建重组质粒pSRSC和pSR2AB,电穿孔技术交又导入原野生菌株81/0342和N315中构建6株细菌转化株,在适宜温度培育下充分表达质粒,应用PCR法检测SCCmec基因岛从染色体上脱落,并连续10 d传代培养细菌,应用影印实验检查细菌的药物敏感性变化.结果 ccrC重组酶基因的PCR扩增产物为1.9 kb,小于Ⅱ型SCCmec基因岛上携带的ccrAB重组酶基因.经鉴定证实成功构建了重组质粒pSR5C和pSR2AB,当菌株81/0342中导入重组质粒pSR5C和pSR2AB后,81/0342所携带的Ⅴ型SCCmec基因岛能从染色体上剪切下来,并以环状DNA结构存在于细菌中,而只有当N315中导入重组质粒pSR2AB时,N315所携带的Ⅱ型SCCmec基因岛才能脱落下来,SCCmec基因岛脱落的细菌成为对妥布霉素和头孢唑肟药物敏感的菌株.结论 ccrC重组酶与ccrAB一样具有特异性剪切酶的功能,可单独介导Ⅴ型SCCmec基因岛的脱落,从而为社区MRSA所携带的Ⅴ型SCCmec基因岛在金黄色葡萄球菌之间的广泛传播提供了实验依据.     

金黄色葡萄球菌分泌超抗原在动物体内外免疫作用机制的研究进展

目的介绍金黄色葡萄球菌分泌的超抗原在动物体内外与免疫系统的作用关系。方法以国内外大量文献资料为依据,对金黄色葡萄球菌分泌的中毒性休克综合征毒素1(TSST-1)、肠毒素A、肠毒素B三种超抗原刺激机体免疫反应的情况作出归纳和总结。结果金黄色葡萄球菌分泌的超抗原通过与体内的免疫系统成分作用,刺激细胞因子过度释放,构成细胞因子网络而诱发疾病。结论对金黄色葡萄球菌分泌的超抗原的研究有助于揭示其诱发疾病的病因以及确定正确的治疗和预防方案。     

迷你SCC重组质粒的构建及ccr重组酶对SCCmec基因岛的整合功能研究

目的构建4组迷你SCC重组质粒载体,并导入受体菌N315ex中,验证并比较ccrC和ccrAB重组酶具有识别特异性DNA片段,进而把Ⅴ型或Ⅱ型SCCmec基因岛整合入细菌染色体上的功能。方法以转化株0342（pSR5C）和N315（pSR2AB）中抽提的染色体DNA为模板,PCR扩增DNA片段attⅤ和attⅡ,并连接到pYT3载体上,构建pYTattⅤ和pYTattⅡ;将PCR扩增的重组酶基因ccrC0342和ccrAB315分别交叉克隆到pYTattⅤ和pYTattⅡ上,构建重组质粒,并导入N315ex受体菌,在适宜温度培育下充分表达质粒,应用在不同温度培养下含药培养基上菌落数量变化及PCR方法,检测各转化株中质粒整合频率,验证质粒插入方向。结果成功构建4组迷你SCC重组质粒。转化株N315ex（pSR5attⅤ）、N315ex（pSR5attⅡ）和N315ex（pSR2attⅡ）中迷你SCC质粒以不同频度和特定方向整合入细菌染色体中,整合效率分别为8.600%、0.005%和7.200%。N315ex（pSR2attⅤ）中未见整合发生。结论与ccrAB仅可识别Ⅱ型SCCmec基因岛的attⅡ相比,ccrC重组酶可识别V型SCCmec的attⅤ和Ⅱ型SCCmec的attⅡ两组DNA片段,发挥其重组整合作用。     

医院内流行社区型MRSA的分子生物学特点分析

目的调查2007~2009年沈阳医院分离MRSA感染的临床类型,并解析MRSA克隆的分子生物学特点。方法记录分析125株MRSA感染者的临床数据;多重PCR法分型SCCmec基因岛;凝固酶试验测定菌株的凝固酶型;聚合酶链式反应(PCR)测定PVL、CNA、SEH、TSST1等毒素基因在菌株中的分布情况。结果在检测的125株MR-SA中,76.0%(95/125)起源于社区,20.8%(26/125)起源于医院。成年MRSA感染平均年龄39.7岁,以皮肤、粘膜感染最常见;儿童患者以上呼吸道感染患者多见。CNA阳性菌株占73.6%,全部分泌4型血浆凝固酶,并携带IVc型SCC-mec基因岛。结论 1株起源于社区,基因型为IVc SCCmec-coagulase4且携带CNA毒素基因的特定MRSA克隆在医院内蔓延。     

社区分离金黄色葡萄球菌在健康人群中的分布及其分子生物学特点

目的 调查医科大学学生鼻腔中金黄色葡萄球菌(金葡菌)的定植状况,解析鼻腔定植社区型甲氧两林耐药性金葡菌(MRSA)克隆的分子生物学特点.方法 以无菌棉签从调查对象鼻腔中收集定植菌,鉴定出甲氧西林敏感性金葡菌(MSSA)和MRSA;多重PCR法分型MRSA携带的SCCmec基因岛;PCR测定pvl、seh、tsst1等毒素基因在菌株中的分布;脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测MRSA菌株的脉冲场型.结果 2009年977名学生488份样本中鉴定出葡萄球菌,其中凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)和金葡菌分别为364份和124份,MRSA在金葡菌中所占比例为3.4%.2010年调查显示,657名学生中有310份样本鉴定为葡萄球菌属,其中CoNS为195份,金葡菌115份,MRSA在金葡菌中所占比例为7.7%.金葡菌在所有葡萄球菌属中所占比例为29.9%,而MRSA在金葡菌中所占比例为5.1%.MRSA菌株中共鉴定出5种SCCmec基因岛型,其中Ⅳa型最多(10株),为优势SCCmec基因岛类型.PFGE共有11种图谱型,7种(A～G)脉冲场型.10株MRSA均为pvl阳性.结论 1株起源于社区,基因型为Ⅳa SCCmec-pulsotype A且携带pvl毒素基因的特定MRSA克隆在健康大学生中传播.

Abstract：

Objective To investigate the nasal colonization of Staphylococcus (S.) aureus strains among medical university students in Shenyang and to study the molecular epidemiological characteristics of methicillin resistant S. aureus (MRSA) strains. Methods Sterilized nasal swabs were used to collect nasal bacteria from both nares of the students. Nasal specimens were further identified as S. aureus strains, sensitive or resistant to methicillin through a series of tests. Molecular related methods including staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing, pulsed- field gel electrophoresis (PFGE) , coagulase isotyping and minimum inhibitory concentration (MIC) determination etc. were used to characterize the isolates. Prevalence of the panton-valentine leukocidin (pvl) genes (lukS and F-PV) among the isolates was also assessed. Results Staphylococci were found in 488 specimens from 977 participants through the surveillance program, conducted in 2009. Of the 488 specimens being tested, 364 were identified as coagulase-negative staphylococci (CoNS) and 124 as S. aureus. MRSA strain among the S. aureus isolates was accounted for 3.4%. In the surveillance program conducted in 2010, staphylococci grew in 310 specimens fiom 657 participants. Of the 310 specimens tested, 195 were identified as CoNS and 115 as S. aureus. The percentage of MRSA strains among the S. aureus isolates was 7.7%. In total, 239 students carried S.aureus, and the percentage of MRSA carriers among the total specimens tested in this study was 5.1%.Most of the MRSA strains could be classified into one of the five types of SCCmec elements. Type Ⅳ a SCCmec strains were most frequent seen overall (10 isolates). A total of 11 pulsotypes were identified among the MRSA strains and were classified into 7 major groups (A to G) by the mutual correlations of their banding patterns. Ten MRSA strains were identified as pvl positive strains. Conclusion An MRSA clone (Ⅳ a SCCmec pulsotype A) carrying pvl toxin gene was found to be prevalent in the nares of the healthy university students.     

MRSAD的耐药机制及临床药物治疗方案相关研究进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种具有强大的致病毒力因子以及耐药性的菌种,在医院和社区获得性感染中具有极其重要的地位.     

MRSA的耐药机制及临床药物治疗方案相关研究进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种具有强大的致病毒力因子以及耐药性的菌种,在医院和社区获得性感染中具有极其重要的地位。     

支气管哮喘并发肺部感染患儿下呼吸道细菌定植及相关指标研究

目的探讨支气管哮喘并发肺部感染患儿下呼吸道细菌定植(LABC)与血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、高迁移率族蛋白-1(HMGB1)及Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)的关系。方法支气管哮喘并发肺部感染患儿240例,根据是否发生LABC分为阴性组116例和阳性组124例,另选取同期健康体检儿童50例为对照组,对比三组儿童的相关指标。结果阳性组最大呼气第一秒呼出的气量容积(FEV1)、肺活量(VC)均小于阴性组、正常对照组(P<0.05),血清VCAM-1、HMGB1及痰标本中TLR2、TLR4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)浓度高于阴性组(P<0.05)。支气管哮喘并发肺部感染患儿血清VCAM-1、HMGB1浓度以及痰液TLR2、TLR4水平是发生LABC的独立危险因素(P<0.05);血清VCAM-1、HMGB1与痰液TLR2、TLR4联合预测支气管哮喘并发肺部感染患儿LABC的曲线下面积为0.891,敏感度、特异度分别为0.85、0.83。结论支气管哮喘并发肺部感染患儿中血清VCAM-1、HMGB1及痰液TLR2、TLR4与LABC存在密切关系,临床上可根据患儿实际情况以及结合以上指标预测患儿预后并及时采取相应的预防措施。