长沙市家禽市场环境中H5N1亚型禽流感病毒传播风险研究

目的 对长沙市家禽市场职业暴露人群进行禽流感病毒（AIV）H5N1亚型抗体水平和环境AIV核酸检测,并对环境中AIV H5N1亚型的血凝素（HA）基因进行测序分析。方法 抽取长沙市1个区和1个县,各选择2个城区或乡镇家禽市场进行职业暴露人群H5N1抗体和环境AIV核酸检测。利用单放射免疫扩散溶血实验（SRH）对102份家禽市场职业暴露人员血清标本进行H5N1抗体检测,real-time PCR方法检测160份家禽市场环境标本（污水、禽类粪便、羽毛和禽类笼具表面涂抹标本）AIV核酸,对4份污水H5N1亚型AIV核酸阳性标本进行HA基因RT-PCR扩增和TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega 5.0软件进行氨基酸比对和进化树构建。结果AIVH5N1抗体监测结果显示,家禽市场职业暴露人群血清H5N1抗体阳性率为25.5%（26/102）,其中乡镇和城区家禽市场职业暴露人群阳性率分别为50.0%（9/18）和25.4%（17/67）,乡镇家禽市场职业暴露人群阳性率高于城区。长沙市家禽市场环境中H5亚型AIV核酸阳性率为31.3%（50/160）,其中乡镇家禽市场阳性率为37.3%（31/83）,高于城区家禽市场24.7%（19/77）;不同标本H5亚型AIV核酸阳性率不同：污水（50.0%,24/48）、羽毛（44.5%,4/9）、禽类粪便（29.8%,14/47）和禽类笼具表面涂抹（14.3%,8/56）;差异均有统计学意义（P＜0.01）。TA克隆测序得到4个AIVH5N1亚型HA基因序列,进化树显示4个AIVH5N1亚型HA基因与中国内地和香港禽来源的AIV分离株为同一分组,属于欧亚分支;4个AIV H5N1亚型HA基因受体结合位点氨基酸序列仍然为禽源（QSG）、HA1和HA2蛋白之间连接肽为多个碱性氨基酸序列（RERRRKK或RERRGKK）,与入源AIV H5N1亚型具有相同的受体结合位点和高致病性的分子特征。结论 长沙市家禽市场环境中存在较多数量的AIVH5N1亚型,是导致职业暴露人群抗体阳性率达25.5%的原因之一;环境中存在的AIVH5N1亚型HA基因表现出来的高致病性分子特征,增加了家禽市场环境中发生AIV传播的风险。     

环介导等温扩增(LAMP)技术检测奇异变形杆菌方法的建立

[目的]建立一种检测奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)快速且特异的环介导等温扩增(LAMP)检测方法. [方法]针对奇异变形杆菌脲酶调节子编码基因(ureR)特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃孵育约60min,完成对奇异变形杆菌的扩增,扩增产物经电泳和酶切鉴定.利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株奇异变形杆菌和13株非奇异变形杆菌来验证LAMP方法的特异性;将奇异变形杆菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法同时进行检测来比较两者敏感性. [结果]1株奇异变形杆菌扩增出LAMP特征性梯状条带,13株非奇异变形杆菌没有出现LAMP扩增,酶切也证实了LAMP产物的特异性;LAMP检测奇异变形杆菌的特异性与普通PCR相同,但其敏感性比普通PCR高10倍:LAMP检测奇异变形杆菌的检测下限为5 cfu/ml,PCR检测下限为50 cfu/ml.LAMP检测速度相比PCR更快速,在60 min内即可完成扩增反应.[结论]建立了一种特异、敏感、快速且不需要特殊设备的奇异变形杆菌LAMP检测方法,有望用于奇异变形杆菌的快速检测.     

逆转录-环介导等温扩增方法检测甲型H1N1流感病毒

2009年3月墨西哥暴发"人感染猪流感"疫情,造成人员死亡.研究发现,此次疫情的病原为变异后的甲型H1N1流感病毒,甲型H1N1流感病毒属于正黏病毒科(orthomyxoviridae),甲型流感病毒属(influenza virus A).该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感3种流感病毒的基因片段,可以在人间传播.     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

沙门菌属LAMP检测方法在食品卫生检验中的应用评价

目的探讨沙门菌属环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法在食品卫生检验中的应用价值。方法利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对135份食品标本进行沙门菌检测,评价LAMP法和分离培养法的一致性。结果 LAMP方法检出14份食品标本沙门菌阳性,阳性率为10.4%,电泳和加荧光染料染色后均能判断结果;分离培养法检出6份食品标本沙门菌阳性,阳性率为4.4%。LAMP法检出阳性率高于培养法(P=0.021)。LAMP方法可在24 h内从食品中检测出沙门菌,而分离培养法检出沙门菌需要4~7 d,LAMP检测方法更快速。结论沙门菌属LAMP方法检测阳性率高于分离培养法,LAMP方法可用于食品中沙门菌的核酸检测。     

10种食源性疾病病原体高通量LAMP分子鉴别检测体系的建立及应用

目的建立一种LAMP分子鉴别检测体系,应用于10种食源性疾病病原体的分子鉴别检测。方法针对8种细菌（沙门菌属、志贺菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、EHEC O157：H7、奇异变形杆菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌）和2种病毒（Norwalk病毒和轮状病毒）分别建立LAMP和RT-LAMP方法,分别对25种常见肠道细菌和病毒进行LAMP扩增,水浴箱内65℃扩增60 min（LAMP）或120 min（RT-LAMP）,扩增完成后利用电泳和肉眼进行结果判断。对365份食源性疾病患者呕吐物、肛拭子和食品等标本进行10种食源性疾病病原体LAMP分子检测。结果 10种食源性疾病病原体LAMP或RT-LAMP方法均只对靶病原体出现阳性结果,电泳显示为LAMP特异性梯状条带,加SYBRGreen I后肉眼观察反应液变为绿色;8种细菌性病原体LAMP检测方法的敏感度为3×100~1.2×102cfu/ml,其中6种LAMP方法敏感度高于PCR方法,其他病原体（霍乱弧菌、EHEC O157：H7、Norwalk病毒和轮状病毒）敏感度与PCR方法相同。从365份标本中检出沙门菌属11份、志贺菌属6份、金黄色葡萄球菌13份、EHEC O157：H7 2份、副溶血性弧菌2份、单增李斯特菌2份、Norwalk病毒12份和轮状病毒7份。结论建立了一个较为完整的LAMP分子鉴别检测体系,可以在一台水浴箱内同时对10种食源性疾病病原体进行高通量的分子鉴别检测,具有快速、不需要特殊仪器和肉眼判断结果的优势,适合基层单位的实验室开展食源性疾病的分子鉴别诊断。     

长沙市饮食从业人员血清ALT与肝炎病毒血清标志关系分析

目的：了解长沙市饮食从业人员ALT异常情况及分析ALT异常与各型肝炎病毒感染之间的关系。方法：采用赖氏法进行ALT检测，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法对132例ALT异常者进行甲-庚型肝炎病毒标志物的分析。结果：ALT异常率为1.42％，甲-庚型肝炎病毒标志阳性率为61.36％。ALT异常者肝炎病毒标志以乙肝病毒为主（28.03％），戊肝病毒12.88％，丙肝病毒10.61％，庚肝病毒5.3％，甲肝病毒3.03％，丁肝病毒1.52％。结论：ALT异常与肝炎病毒感染呈相关性，应重视从业人员中ALT异常者对病毒性肝炎的传播作用。     

长沙市甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因序列分析

目的对长沙市甲型H1N1流感病毒A/changsha/78/2009的神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因进行测序分析,以期了解该病毒的来源及变异情况。方法利用国家流感中心（CNIC）和世界卫生组织（WHO）推荐的NA基因测序引物和CEQTM8000 Genetic Analysis System对2009年长沙市甲型H1N1流感患者阳性鼻咽拭子标本（A/changsha/78/2009）进行测序,测序结果提交至GenBank并利用Lasergene和Mega5软件对测序结果进行氨基酸比对和进化树分析。结果 A/changsha/78/2009 NA基因GenBank登录号为：GQ463958.1,与瑞典斯德哥尔摩甲型H1N1流感病毒分离株A/Stockholm/37/2009（H1N1）核苷酸同源性为100%;进化树分析显示A/changsha/78/2009 NA基因属于欧亚猪流感分支,包含A/changsha/78/2009在内的甲型H1N1流感病毒与A/swine/Spain/WVL6/1991（H1N1）亲缘关系近;A/chang-sha/78/2009与A/swine/Spain/WVL6/1991 NA基因均有7个潜在糖基化位点,A/changsha/78/2009 NA基因未发生H274Y位点突变。结论包含A/changsha/78/2009在内的甲型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒,A/changsha/78/2009病毒对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感。     

诺麻喷鼻剂的研制及稳定性研究

急性、慢性鼻 (窦 )炎及肥大性鼻炎是临床常见病、多发病 ,目前治疗中仍以呋麻滴鼻液为主 ,品种少 ,使用也不方便。为了增加药物在鼻腔内的吸收速度 ,本研究以诺氟沙星与盐酸麻黄碱为主药 ,配制诺麻喷鼻剂 ,同时考查了该制剂的稳定性。用紫外分光光度法和旋光法分别测定诺氟沙星与盐酸麻黄碱的含量 ,用初匀法考查其稳定性 ,结果两主药含量测定的平均回收率分别为 99.5 % (RSD=0 .5 7% )和10 2 .0 % (RSD=0 .31% ) ;预测室温贮存期 2 .5年。证明该制剂的配制工艺及质量控制方法可行 ,室温贮存期较长 ,具有临床使用价值。与目前使用的呋麻…     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立

建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的六个区域设计四条LAMP引物，65℃保温约60min，完成对沙门菌属的扩增，扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证LAMP方法的特异性；将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌没有出现LAMP扩增，LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实；LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu／ml，PCR检测下限为100cfu／ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。