rTpNl7和rTpN47及其融合蛋白酶联免疫吸附试验检测梅毒血清标本的效果

目的构建梅毒螺旋体tpnl7、tpn47基因及tpnl7-tpn47融合基因原核表达系统，建立基于rTpNl7、rTpN47和rTpNl7-TpN47的ELISAs并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法采用常规分子生物学方法扩增并克隆梅毒螺旋体tpnl7和tpn47基因，以连接引物PCR构建tpnl7-tpn47人工融合基因，建立上述目的基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rTpNl7、rTpN47和rTpNl7-TpN47表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯上述目的重组蛋白，Western blot检测其免疫性。分别以rTpNl7、rTpN47和rTpNl7-TpN47为包被抗原，建立相应ELISAs检测健康人群、类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）患者及梅毒患者血清标本中梅毒抗体并与现行TRUST和TPHA进行比较。结果克隆的tpnl7、tpn47基因及构建的tpnl7-tpn47融合基因与GenBank中相关序列相似性为100％。rTpNl7、rTpN47和rTpNl7-TpN47表达量分别为细菌总蛋白的37．2％、23．3％和29．8％，其提纯物电泳后均显示单一条带，并均能与梅毒抗体阳性血清发生明显的结合反应。rTpNl7-ELISA、rTpN47．ELISA和rTpNl7-TpN47-ELISA对所有健康人血清、RA和SLE患者血清标本的检测结果均为阴性，对梅毒患者血清标本检测阳性率分别为84．4％、82．3％和98．1％，其中rTpNl7-ELISA和rTpN47-ELISA检测阳性率低于TPHA（P〈0．01），rTpNl7-TpN47-ELISA检测阳性率相似（P〉0．05），但均高于TRUST（71．4％）。结论研究中建立的rTpNl7-ELISA、rTpN47-ELISA，尤其是rTpNl7-TpN47-ELISA，有望成为快速、简便、安全的梅毒患者血清学筛查方法。     

问号钩端螺旋体脂蛋白LipL32膜定位及其免疫应答

目的 确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性脂蛋白抗原LipL32膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型.方法 IPTG诱导目的 重组蛋白rLipL32-1和rLipL32-2表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rLipL32.采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区钩体患者血清标本及rLipL32兔抗血清与我国问号钩体参考标准株的交叉凝集情况.采用胶体金免疫电镜技术对LipL32进行膜定位.建立基于rLipL32的ELISA,检测钩体患者血清中特异性抗体类型及其水平.结果 黄疸出血群是四川地区最主要的优势钩体血清群.rLipL32兔抗血清均能与我国问号钩体参考标准株发生MAT效价为1∶80～1∶320的交叉凝集反应.LipL32是位于钩体外膜表面的蛋白质分子.156例MAT阳性钩体患者血清标本中,rLipL32-1和rLipL32-2特异性IgM阳性率分别为91.0%～92.9%和90.4%～92.3%,特异性IgG阳性率分别为99.4%和97.4%～98.1%.结论 LipL32是问号钩体属特异性表面蛋白抗原.自然感染钩体时,LipL32-1和LipL32-2可诱导机体产生IgM和IgG两类血清抗体.rLipL32-1和rLipL32-2可作为研制检测试剂盒的候选抗原.     

我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析

目的 分析我国15群15型问号钩端螺旋体（简称钩体）参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列，构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性，了解lipL21基因自然表达状况。方法 高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Paloc型PalocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段，T-A克隆后测序并构建其原核表达系统。分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性，显微镜凝集试验（MAT）检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价。以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白，用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况。结果 上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98．75％～99．82％和99．46％～100％。rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipL21兔抗血清发生结合反应。rLipL21免疫家兔能产生抗体，该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1：16～1：128。问号钩体外膜标本中均可检出LipL21，双曲钩体则否。结论 我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜，双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达。rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性，有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一。     

问号钩端螺旋体属特异性LipL41s抗原膜定位及其患者血清抗体检测

目的确定问号钩端螺旋体（钩体）属特异性脂蛋白抗原LipL41s膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型。方法采用显微镜凝集试验（MAT）检测四川地区钩体病患者血清标本。IPTG诱导重组原核系统表达目的蛋白rLipL41／1和rLipL41／2，Ni—NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物。采用Westernblot检测感染不同血清群问号钩体病患者血清与rLipL41s的免疫反应性。采用胶体金免疫电镜技术，对LipL41s进行膜定位。建立基于rLipL41s的ELISA，检测钩体病患者血清中特异性抗体水平及其类型。结果黄疸出血群是四川地区最主要的优势钩体血清群。不同血清群问号钩体病患者血清均能有效识别LipL41s。LipL41s是位于钩体外膜表面的蛋白分子。156例MAT阳性钩体病患者血清标本中，rLipL41／1和rLipL41／2特异性IgM阳性率分别为84．6％～87．8％和78．2％～83．3％，特异性IgG阳性率分别为69．2％～81．4％和75．0％～80．1％。结论LipL41s是钩体表面蛋白抗原。自然感染钩体时，LipL41／1和LipL41／2可诱导机体产生IgM和IgG两类血清抗体，且两者之间有广泛的抗原交叉反应。rLipL41／1和rLipL41／2可作为研制通用型钩体基因工程疫苗和检测试剂盒的候选抗原。     

钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究

目的 确定致病性问号钩端螺旋体（钩体）属特异性外膜蛋白的抗原性和交叉免疫反应性，为研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒提供依据。方法采用Ni—NTA亲和层析法，提取了4种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物rLipL21、rLipL32／1和rLipL32／2、rLipL41／1和rLipL41／2、rOmpL1／1和rOmpL1／2，并用SDS-PAGE检测表达及提纯效果。上述重组蛋白常规皮下免疫家兔获得抗血清，显微镜凝集试验（MAT）检测各抗血清交叉凝集效价。采用盐变法提取了我国15群问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体Patoc Ⅰ株的外膜蛋白。以免抗血清为一抗，采用Westernblot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性。结果 rLipL21、rLipL32／1和rLipL32／2、rLipL41／1和rLipL41／2、rOmpL1／1和rOmpL1／2表达量分别约占细菌总蛋白的10％、40％和35％、15％和10％、30％和15％，各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带。重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性．与不同钩体血清群的MAT效价为1：2～1：128。各血清群钩体外膜中均可检出上述4种外膜蛋白，但LipL21仅存在于问号钩体中。结论 LipL21、LipL32、LipL41、OmpL1均为钩体属特异性表面抗原，可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原。     

问号钩端螺旋体病人血清中LipL21抗体检测

寻找钩体属特异性保护抗原,对于研制通用型钩体疫苗及实验室诊断试剂盒均有重要价值。Cullen等首先报告了致病性问号钩体均具有属特异性lipL21脂蛋白基因。我们也曾证实我国15群15型问号钩体参考标准株均含有序列保守的lipL21基因。已知钩体病免疫保护作用主要依赖血清抗体为主的体液免疫。我们采用显微镜凝集试验(MAT)检测了156份钩体病人血清的凝集效价,并建立rLipL21-IgM/IgG-ELISAs对血清标本中LipL21的IgG和IgM型抗体进行了检测。