应用IRS-PCR对金黄色葡萄球菌分型的研究

目的探讨低频限制性位点聚合酶链反应(infrequent-restriction-site PCR，IRS-PCR)在金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)基因分型中的应用价值。方法建立本实验室IRS-PCR方法。同时用IRS-PCR和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对金葡菌进行基因分型。根据49株社区感染分离菌的分型结果计算辨别力指数(ID)值估计分辨力。对其中30株社区感染菌重复实验一次估计重复性。比较两种基因分型方法的分型率、分辨力、重复性、结果的一致率及操作特点。结果建立IRS-PCR对金葡菌基因分型的方法。70株金葡菌均可被2种方法分型，分型率100％。IRS-PCR分为38个型，21株院内感染菌分为6个型，49株社区感染菌分为32个型，计算ID值为0．981。PFGE分为40个型，21株院内感染菌分为6个型，49株社区感染菌分为34个型，计算ID值为0．983。两种分型方法的重复性均为100％。对院内感染菌，两种方法分型的一致率为100％；对社区感染菌，两种方法分型的一致率为92％(45／49)。与PFGE相比，IRS-PCR更简单、省时、易于操作、不需特殊昂贵仪器。结论IRS-PCR能对金葡菌简易快速可靠分型，适合检验科对临床标本的快速有效分型，是一种有价值的分子流行病学研究工具。     

儿科对碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌产金属酶的研究

目的 了解目前儿科对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌产金属酶的情况。方法 本研究收集了2003年12月至2005年11月，北京儿童医院住院患儿中分离出对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌59株。使用E试验法检测金属酶的耐药表型，PCR技术检测编码金属酶的IMP、VIM、SPM和GIM4种基因型。结果 本研究59株对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌中，29株金属酶耐药表型结果阳性，占49．2％。39株金属酶基因型阳性，占66．1％，其中扩增出IMP型阳性35株，占89．7％，VIM型阳性4株，占10．3％。未检测出SPM和GIM型金属酶。对哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦产金属酶不敏感率高于非产金属酶菌株，差异有统计学意义（P〈0．05）。对产金属酶菌株β-内酰胺类抗生素头孢噻肟、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮-舒巴坦的MIC90均达到256μg／ml，MIC90均大于256μg／ml，高于非产金属酶菌株。结论 从本研究分离的菌株显示儿科铜绿假单胞菌产金属酶率高于成人报道，产金属酶是儿科分离对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌的重要耐药机制。且以产IMP型金属酶为主，少部分产VIM型金属酶。产金属酶菌株对β-内酰胺类抗生素耐药比非产金属酶菌株更严重，尤其对哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦耐药性高。E试验法易用于铜绿假单胞菌产金属酶的初步筛选，但不能单独作为检测铜绿假单胞菌产生金属酶的确证性试验。     

儿童社区获得性呼吸道感染的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌耐药性监测

目的监测2000-2004年连续5年5岁以下呼吸道感染患儿鼻咽拭子分离的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药性.方法采用E试验和K-B纸片法对临床分离541株肺炎链球菌、521株流感嗜血杆菌进行抗菌药物耐药性测定.结果肺炎链球菌对青霉素不敏感率由2000年的22%增加到2004年的32.9%,P＜0.05;对头孢呋辛和头孢克洛不敏感率由7%增加到25%左右,P＜0.01;对红霉素不敏感率由88%增加到94.3%,P＞0.05;对四环素和复方磺胺甲噁唑不敏感率分别为90%以上和80%以上.流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率和产β内酰胺酶率由2000年的5.0%增加到2004年的14.3%,P＜0.05;对阿莫西林-克拉维酸、头孢曲松和头孢呋辛非常敏感;对头孢克洛不敏感率由2%增加到14.3%,P＜0.01.结论肺炎链球菌对青霉素不敏感率和流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率和产β内酰胺酶率呈明显上升趋势.     

上呼吸道感染患儿肺炎链球菌血清群/型及耐药分析

目的了解患上呼吸道感染的0~5岁儿童肺炎链球菌的血清群/型及其对抗生素耐药情况。探讨肺炎链球菌疫苗在中国儿童使用的意义。方法取患儿鼻咽分泌物,分离出137株肺炎链球菌。采用荚膜肿胀法(Quellinngtest)进行血清群/型分析。E-test及K-B纸片扩散法检测对青霉素等13种抗生素的敏感性。结果疫苗相关血清型占63%,最常见的血清群/型为19、6、23、14。青霉素不敏感率为33%,较往年增高。青霉素耐药菌株对头孢类抗生素有交叉耐药性,红霉素、阿奇霉素耐药率达94%,应引起临床高度重视。结论疫苗相关血清群/型在0~5岁儿童覆盖率较高,肺炎链球菌疫苗的使用有利于降低儿童肺炎链球菌感染的发病率,有助于减少抗生素耐药的产生。     

儿童肺炎链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类和氟喹诺酮类抗菌药物敏感性研究

目的了解2002 2004年北京儿童医院门诊5岁以下呼吸道感染儿童鼻咽拭子中分离出的肺炎链球菌,对β-内酰胺类、大环内酯类和氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性。方法使用E试验法(E-test)对114株肺炎链球菌进行抗菌药物的敏感性试验。结果114株肺炎链球菌对青霉素不敏感率为36%,对阿莫西林/棒酸全部敏感,对头孢菌素中头孢曲松不敏感率为6.1%,头孢呋辛为30.7%,头孢克洛为29%,大环内酯类耐药率在90%左右,全部菌株对氟喹诺酮类敏感。结论儿童肺炎链球菌对青霉素和头孢二代抗菌药物不敏感率为29%~36%,对大环内酯类耐药在90%左右,未发现对氟喹诺酮类耐药菌株。     

不同青霉素红霉素敏感性组合模式肺炎链球菌的抗生素敏感性特征

目的分析不同青霉素和红霉素敏感性组合模式的肺炎链球菌对其他常用抗生素敏感性分布的特征,探讨监测青霉素和红霉素敏感性是否具有代表性意义。方法对2000—2002年每年2～5月北京、上海、广州三家儿童医院门诊就诊(年龄1个月至5岁)的急性上呼吸道感染儿童鼻咽部分离肺炎链球菌,采用纸片扩散法和E-test最小抑菌浓度(MIC)法检测其对8种常用抗生素的敏感性。结果将青霉素敏感性分为R(耐药)、I(中介)和S(敏感),红霉素敏感性分为NS(不敏感)和S(敏感),按青霉素敏感性/红霉素敏感性组合模式可分为6组(没有分离到R/S模式菌株)。R/NS组29·8%(17/57)对头孢曲松不敏感;对头孢呋辛和头孢克洛均不敏感;阿莫西林/克拉维酸不敏感株只出现于R/NS组。I/NS组仅0·03%(8/288)对头孢曲松不敏感;头孢呋辛和头孢克洛不敏感率分别为38·2%(110/288)和52·4%(151/288)。头孢克洛不敏感菌株还出现于I/S组。复方新诺明敏感性主要与红霉素是否敏感有关。氯霉素耐药株在各组分布的差异没有统计学意义。R/NS和I/NS几乎都是联合耐药株,S/S组无联合耐药株。结论不同青霉素和红霉素敏感性组合模式的肺炎链球菌对其他常用抗生素敏感性分布具有各自不同的特点,青霉素和红霉素是肺炎链球菌耐药性监测的代表性药物。     

基因多态性分析在凝固酶阴性葡萄球菌菌种鉴定中的应用

目的建立快速凝固酶阴性葡萄球（CNS）菌种的基因鉴定方法。方法对培养获得的、经Auto Scan-4微生物分析仪和API Staph鉴定系统鉴定为CNS的100株临床分离菌株和质控菌株应用tRNA基因间长度多态性PCR分析（tDNA-PCR）和肠杆菌基因间相同序列（ERIC）两种分子生物学方法进行常见的CNS菌种鉴定，同时改良实验条件，并将tDNA-PCR及ERIC-PCR两种分子生物学方法的鉴定结果与传统的Auto Scan-4微生物分析仪和API Staph鉴定系统进行比较。结果tDNA-PCR及ERIC-PCR两种分子生物学方法对质控菌株及经Auto Scan-4微生物分析仪和API Staph系统鉴定的12种临床分离CNS菌株均可以得到各自不同的电泳图谱，它们可以快速、准确地对常见12种CNS，包括表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、华纳葡萄球菌、模仿葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、心耳葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、头状葡萄球菌、施氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌和里昂葡萄球菌进行菌种鉴定。从图谱的肉眼观察看，12种CNS均可以很好地鉴别开。tDNA-PCR及ERIC-PCR与Auto Scan-4和API Staph鉴定系统的一致率为95％。经Taq酶聚合后进行电泳，tDNA-PCR在100～600bp产生6～10条DNA片段；ERIC-PCR在100～1200bp仅产生1～8条DNA片段。结论tDNA-PCR及ERIC-PCR是快速、敏感的CNS菌种鉴定的方法，具有高度的特异性。     

2000-2005年自北京儿童医院门诊患儿鼻咽部分离的19群肺炎链球菌的耐药性变化

目的明确2000—2005年分离的北京儿童19群肺炎链球菌的抗生素敏感性分布及年代变化特点。方法采用简易棋盘式肺炎链球菌分型系统以荚膜肿胀试验进行血清分型。E—test法检测分离株对青霉素等6种抗生素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations,MIC）。结果2002—2003年和2004—2005年肺炎链球菌19群在分离的青霉素不敏感肺炎链球菌中所占比例明显升高,青霉素、头孢克洛和头孢呋辛钠敏感率明显下降,MIC50、MIC90和最大MIC值的水平升高。从MIC值分布看,19群分离株对阿莫西林／克拉维酸和头孢曲松的敏感性下降,但仍处于判定标准的敏感范围。结论2000—2005年自北京儿童医院门诊患儿鼻咽部分离的肺炎链球菌19群对β内酰胺类抗生素耐药性增强,耐药株增多。     

儿童患者中对碳青霉烯类耐药的绿脓假单胞菌产金属酶基因型研究

目的研究儿童患者中对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌产金属酶的基因型。方法本研究收集了2003年12月至2005年11月我院住院患儿中分离出的对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌59株。使用E试验法检测产金属酶的耐药表型，PCR技术检测编码金属酶的IMP、VIM、SPM和GIM4种基因型。PCR反应产物进行纯化后，使用双脱氧末端终止法进行DNA测序。将得到的拼接序列与GenBank中Blast进行同源分析，确定其基因亚型。结果59株对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌中，纸片法检测金属酶表型结果阳性29株，占49．2％。PCR检测金属酶基因型阳性39株，占66．1％，其中IMP型阳性35株，占89．7％，VIM型阳性4株，占10．3％。未检测出SPM和GIM型金属酶。测序结果显示，IMP型测序结果均为产IMP．1亚型金属酶的绿脓假单胞菌。VIM型测序结果均为产VIM-2亚型金属酶的绿脓假单胞菌。结论儿童患者中对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌，产金属酶率高于成人报道。产生的金属酶同时存在IMP-1和VIM-2两种基因型，其中以IMP-1亚型为主，少部分为VIM-2亚型。产金属酶是儿童患者对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌的重要耐药机制。在儿科进行对碳青霉烯类耐药的绿脓假单胞菌产金属酶的监测十分重要。     

儿童临床分离多重耐药铜绿假单胞菌的耐药性分析

目的了解儿童临床分离多重耐药铜绿假单胞菌的耐药特征。方法收集我院住院患儿中分离的120株多重耐药铜绿假单胞菌，作药敏试验，用琼脂稀释法测定抗菌药物的MIC值，按照2005年CLSI推荐标准判断结果。数据分析使用WHONET5．3软件。结果多重耐药铜绿假单胞菌对氨曲南的耐药率最高（86．7％），头孢他啶仍具较好的抗菌活性；环丙沙星耐药率最低（2．5％）。亚胺培南和美罗培南的耐药率分别达到34．2％、35．8％，两者MIC50和MIC50相同，分别为4和32mg／L。59株细菌对碳青霉烯类抗生素耐药，占49．2％。碳青霉烯类抗生素耐药株与非耐药株对头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-三唑巴坦的耐药率差异有显著性（P〈0．05）。结论目前从儿科临床分离多重耐药铜绿假单胞菌的多重耐药现象严重。