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1.
NS特异性siRNA真核表达载体的构建   总被引:14,自引:3,他引:11  
目的:构建nucleostemin(核干细胞因子,NS)特异性siRNA真核表达载体。方法:以小鼠组织基因组DNA为模板,PCR方法克隆小鼠编码U6 snRNA基因的启动于,将NS—siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动于连接起来,并将其插入pcDNA4/C载体中。结果:(1)从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6 snRNA基因的启动子,(2)构建了含有U6启动子、NS—siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS—siRNA表达的片段,(3)将NS—siRNA表达片段插入了pcDNA4/C真核表达载体。结论:构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体pcDNA4/C—NS—Silencer。  相似文献
2.
siRNA抑制肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的研究   总被引:6,自引:0,他引:6  
目的 研究siRNA对肝癌细胞株HepC2中Survivin基因表达的抑制作用。方法 设计、合成一对Survivin编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体Psilencer2.1,构建siRNA真核表达载体,经稳定转染HepG2细胞后应用RT-PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中Survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。结果 测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT-PCR及流式细胞术检测,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制Survivin基因表达分别达73%和75%。结论 构建的:Psilencer( )-Survivin重组质粒能有效抑制Survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达。为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。  相似文献
3.
Kang CS  Pu PY  Wang GX  Li YH  Dong L  Wang H 《Zhonghua yi xue za zhi》2004,84(18):1503-1508
目的 比较靶向表皮生长因子受体 (EGFR)的小分子干扰RNA与反义RNA构建体对TJ90 5人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法 选择人EGFR的二个siRNA靶序列构建靶向EGFR的siRNA表达质粒 ,并以反义EGFRRNA为对照进行脂质体介导的TJ90 5人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用免疫荧光和蛋白印迹检查EGFR的表达水平 ;应用TUNEL法分析细胞凋亡 ,流式细胞术分析细胞周期变化 ,MTT法分析细胞增殖 ;蛋白印迹检测基质金属蛋白酶 9的表达 ,明胶酶谱分析MMP9酶活性 ,Transwell法分析侵袭能力。结果 与TJ90 5细胞和转染空载体的TJ90 5细胞比较 ,转染反义EGFRRNA使EGFR表达下调 82 % ,转染siRNA表达质粒组EGFR表达下调 90 %和 92 %。TJ90 5组和空载转染组几乎没有凋亡细胞 ,反义EGFR转染组与siRNA表达质粒组的凋亡率明显增加 ( χ2 =31 5 4 9,P <0 0 0 1) ;siRNA表达载体转染后S期指数较对照和反义RNA转染组细胞明显减少 ,与TJ90 5组和空载转染组比较 ,转染组细胞自第 1天起存活率均明显下降 (P <0 0 0 1) ,且反义组与siRNA表达载体转染组之间存活率差异有显著意义 (P <0 0 1) ;同时蛋白印迹发现转染siRNA表达载体后MMP 9的表达明显下调 ,明胶酶谱分析发现在反义组与siRNA表达载体转染组MMP 9酶活性明显下降 ,以siRNA  相似文献
4.
小干扰RNA对人淀粉样前体蛋白基因的沉默作用   总被引:6,自引:5,他引:1  
目的 观察小干扰RNA(siRNA)对人淀粉样前体蛋白(APP)基因的沉默作用,方法 该研究将设计好的一对寡核甘酸在细胞内源性地转录成小发夹RNA(shRNA),同时构建了携带两个APP亚型的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的GFP-APP重组质粒。利用EGFP作为报告基因。在COS-7细胞内通过共转染siRNA表达质粒和GFP-APP的重组质粒来观察沉默效应。结果 针对APP的siRNA可有效地下调APP基因。结论 针对APP的siRNA将不仅在研究APP基因功能和深入研究阿尔茨海默病(AD)的病理分子机制上,而且在运用siRNA这种新型的反应核酸药物治疗AD方面扮演重要角色。  相似文献
5.
小分子干扰RNA片段逆转KBv200细胞多药耐药的实验研究   总被引:5,自引:4,他引:1  
目的:研究小分子干扰RNA片段(siRNA)对舌癌多药耐药(MDR)细胞系KBv200细胞的MDR1基因表达及其功能的影响,探讨siRNA作为未来化疗增敏剂的可能性。方法:运用针对MDR1基因序列的siRNA(MDR1-siRNA)在脂质体的介导下转染KBv200细胞;用RT—PCR分析MDR1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测P-糖蛋白(P-gP)的表达;荧光分光光度法检测细胞内多柔比星(Dox)的积蓄;MTT法检测KBv200细胞对长春新碱(VCR)和Dox的敏感性变化。结果:MDR1-siRNA作用24和48h能抑制MDR1基因的表达(P〈0.05),其mRNA水平和P-gP水平均明显下降,同时使KBv200细胞对VCR和Dox的敏感性显著增加(P〈0.01),并显著增加细胞内Dox的蓄积(P〈0.01)。结论:MDR1-siRNA能显著抑制KBv200细胞内MDR1基因介导的MDR。  相似文献
6.
7.
 【目的】为探索治疗白血病的新思路研究了小干扰RNA(siRNA)对肿瘤细胞株HL60和人血管内皮细胞(EC)株EA·hy926血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)基因表达的抑制作用。【方法】制备并筛选VEGFR2基因的最有效siRNA,并据此设计shRNA寡核苷酸链,构建pENTR^TM/U6干扰表达载体。瞬时转染细胞.采用MTF法、RT-PCR法及Western blot测定VEGFR2表达抑制情况。【结果】VEGFR2 siRNAa、b、c抑制HL60细胞效率分别为77.5%、45.0%、80.9%,以siRNAc最高,利用其shRNA和pENTR^TM/U6构建的入门克隆转染HL60,抑制细胞效率达99.1%;此入门克隆对VEGF&基因mRNA和蛋白的表达抑制在HL60和EA·hy926细胞均显著。【结论】在体外shRNA表达载体可有效抑制HL60细胞VEGFR2自分泌和旁分泌,有效抑制白血病细胞生长。  相似文献
8.
Background Survivin, a member of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family, overexpresses in tumor cells and not expresses in terminally differentiated adult tissues. This study aimed to investigate the effects of survivin-specific siRNA on cell proliferation, apoptosis and chemosensitivity to cisplatin in vitro and in vivo and explore the mechanisms about decreasing expression of survivin in reversing cancer cells resistance to chemotherapeutic drug.Methods Survivin-specific siRNA was transfected into A549/DDP cells. The expression of survivin and lung resistance-related protein (LRP) mRNA levels were determined by RT-PCR, chemosensitivity of A549/DDP (cisplatin)cells to cisplatin was determined by MTT assay, and apoptosis and cell cycle were determined by flow cytometry (FCM).The protein expression levels of survivin, LRP, cyclin-D1, caspase-3 and bcl-2 were determined by Western blotting analyses. The effect of survivin siRNA inhibition on tumor growth was studied in athymic nude mice in vivo.Results Survivin-specific siRNA efficiently down-regulated survivin expression. The cell cycle was arrested at G2/M phase, and apoptosis was obviously found. Inhibition of survivin expression could make the IC50 and drug-resistant index of cisplatin decrease, and enhance the cancer cells sensitivity to cisplatin. After transfection by survivin-specific siRNA, expression of LRP and cyclin-D1 were downregulated, caspase-3 expression was upregulated, bcl-2 expression had no obvious change. The animal experiment confirmed knockdown of survivin could inhibit the tumor growth.Conclusions Survivin-specific siRNA can efficiently suppress the expression of survivin, increase apoptosis, inhibit cells proliferation and enhance the chemosensitivity to cisplatin in vitro and in vivo. Suppression of survivin expression helping to reverse drug-resistance may have relationship with downregulation of LRP and upregulation of caspase-3.Anti-tumor strategies based on the inhibition of survivin may be useful in targeting lung adenocarcinomas.  相似文献
9.
李维青  郑建  刘桐林  李简 《中国现代医学杂志》2006,16(8):1192-1194,1202
目的 为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗,构建针对survivin基因的siRNA的表达载体,转染细胞EC109后观察其对survivin基因表达的抑制作用。方法 利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因mRNA的寡核苷酸序列,插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survivin。重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109,western blot检测转柒前后survivin蛋白的表达情况。结果 测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致,证实成功构建了针对survivin基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达。结论 针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建,并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达。  相似文献
10.
HER-2 siRNA对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的:观察表皮生长因子受体2(HER-2)siRNA转染SKOV-3细胞抑制HER-2表达后对卵巢癌细胞耐药性的影响.方法:体外转录合成HER-2序列特异性双链RNA(dsRNA),转染SKOV-3细胞株中,RT-PCR方法检测转染前后HER-2基因的mRNA的表达,MTT法检测顺铂对转染前后卵巢癌细胞的生长抑制率.结果:HER-2siRNA转染72 h后,对SKOV-3细胞HER-2 mRNA表达明显抑制.在不同浓度顺铂(0.05~50μg/ml)的作用下,转染HER-2 siRNA与转染非特异性siRNA、空白对照组相比,差异有十分显著性意义(P<0.01).细胞对顺铂的敏感性约提高10倍.结论:体外转录合成的siRNA能有效抑制SKOV-3细胞中HER-2的表达,提高细胞对顺铂的敏感性,RNA干扰技术为卵巢癌的治疗提供了一种新策略.  相似文献
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