首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
文章检索
  按 检索   检索词:      
出版年份:   被引次数:   他引次数: 提示:输入*表示无穷大
  收费全文   1227篇
  免费   74篇
  国内免费   73篇
耳鼻咽喉   15篇
儿科学   9篇
妇产科学   34篇
基础医学   203篇
口腔科学   35篇
临床医学   101篇
内科学   157篇
皮肤病学   10篇
神经病学   62篇
特种医学   32篇
外科学   237篇
综合类   204篇
预防医学   36篇
眼科学   19篇
药学   101篇
中国医学   1篇
肿瘤学   118篇
  2023年   2篇
  2022年   3篇
  2021年   4篇
  2020年   4篇
  2019年   3篇
  2018年   5篇
  2017年   9篇
  2016年   16篇
  2015年   21篇
  2014年   42篇
  2013年   66篇
  2012年   86篇
  2011年   103篇
  2010年   102篇
  2009年   103篇
  2008年   102篇
  2007年   112篇
  2006年   105篇
  2005年   102篇
  2004年   84篇
  2003年   61篇
  2002年   62篇
  2001年   46篇
  2000年   31篇
  1999年   27篇
  1998年   13篇
  1997年   16篇
  1996年   8篇
  1995年   11篇
  1994年   5篇
  1993年   7篇
  1992年   3篇
  1991年   3篇
  1989年   2篇
  1988年   3篇
  1986年   1篇
  1985年   1篇
排序方式: 共有1374条查询结果,搜索用时 15 毫秒
1.
Transfection-based cellular control has been widely used in biology; however, conventional transfection methods cannot control spatio-temporal differences in gene expression or the quantity of delivered materials such as external DNA or RNA. Here, we present a non-viral and spatio-temporally controlled transfection technique of a quantitative injection into a single cell. DNA was quantitatively injected into a single cell at a desired location and time, and the optimal gene delivery and expression conditions were determined based on the amount of the delivered DNA and the transfection efficacy. Interestingly, an injection of 1500 DNAs produced an about average 30% gene expression efficiency, which was the optimal condition, and gene expression was sustained for more than 14 days. In a single cell, fluorescent intensity and polymerase chain reaction (PCR) results were compared for the quantity of gene expression. The high coincidence of both results suggests that the fluorescence intensity can reveal gene expression level which was investigated by PCR. In addition, 3 multiple DNA genes were successfully expressed in a single cell with different ratio. Overall, these results demonstrate that spatio-temporally controlled transfection by quantitative transfection is a useful technique for regulating gene expression in a single cell, which suggests that this technique may be used for stem cell research, including the creation of induced pluripotent stem (iPS) cells.  相似文献   
2.
目的构建携小鼠细胞表面活化蛋白CD69和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞内核糖体切入位点(IRES)的表达载体pLCK-CD69-IRES-EGFP, 并基于此创建CD69转基因小鼠。方法首先通过小鼠肺组织提取RNA, 逆转录成为cDNA, 经过PubMed搜索设计PCR引物, PCR法扩增mCD69片断, 接着将该DNA片段经测序验证后接入pInsulater-LCK-IRES-EGFP质粒, 构建pLCK-CD69-IRES-EGFP转基因载体; 再将其转染到293T细胞中, 通过荧光显微镜技术确定其在293T细胞中的表达状况; 最后将载体显微注射入受精卵并移植入假孕母小鼠, 出生小鼠取尾经PCR鉴定获得阳性首建鼠, 并通过荧光显微镜和流式细胞术确定淋巴细胞上CD69的表达。结果经酶切、DNA测序鉴定证实pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体构建成功; 荧光倒置显微镜检查证实其在转染的293T细胞内的蛋白表达; 小鼠取尾PCR鉴定明确CD69转基因小鼠创建成功; CD69转基因小鼠有外周血淋巴细胞的减少及静息状态下CD69的表达。结论成功构建pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体及制备CD69转基因小鼠, 为CD69在炎症性疾病中作用的整体模型研究奠定了基础。  相似文献   
3.
目的探讨miR-192-5p在多发性骨髓瘤中的表达水平及其调控机制。方法选取骨髓瘤细胞株U266作为研究对象,利用荧光定量PCR检测多发性骨髓瘤细胞中miR-192-5p的表达水平;使用生物信息学网站预测miR-192-5p潜在靶基因USP1并利用双荧光素酶报告实验验证其靶向关系;利用细胞转染实验对多发性骨髓瘤细胞株进行miR-192-5p mimics、miR-192-5p inhibitor及相关对照组的细胞转染,采用CCK-8法和流式细胞仪分别检测转染后细胞的增殖和凋亡情况;利用Western blot检测转染后细胞中USP1蛋白表达水平。结果qRT-PCR结果显示,转染后多发性骨髓瘤细胞中miR-192-5p表达水平低于正常骨髓细胞(P<0.01);CCK-8细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell体外侵袭转移实验和流式细胞仪检测实验结果显示,过表达miR-192-5p抑制骨髓瘤细胞的增殖、迁移、侵袭,促进骨髓瘤细胞的凋亡;靶基因预测及验证实验结果显示USP1是miR-192-5p的靶基因,miR-192-5p的表达可以显著降低骨髓瘤细胞中USP1蛋白的表达。结论miR-192-5p在多发性骨髓瘤中可能作为抑癌基因发挥作用,通过靶向作用于USP1抑制多发性骨髓瘤的发展。  相似文献   
4.
目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因修饰诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的生物学特性。方法 将培养好的iPS细胞分为3组,即N0(纯iPS培养)组、N1(空腺病毒载体转染iPS)组、N2(转染VEGF基因的iPS)组; 3组细胞分别进行传代培养,并采用MTT方法检测转染VEGF基因对细胞增殖的影响; 采用酶联免疫(ELISA)方法检测细胞培养上清液中VEGF的表达水平。结果 转染VEGF基因对iPS细胞增殖没有明显影响; N2组iPS细胞分泌的VEGF蛋白表达水平较N1组显著增加(P<0.05)。结论 经VEGF基因转染的iPS可正常存活生长,并可稳定表达该基因。  相似文献   
5.
目的 探究人源骨骼肌电压门控钠通道hNav1.4 I1363T突变体导致患者出现先天性副肌强直症状的机制。 方法 利用氨基酸序列比对,检测hNav1.4 I1363位点的保守性;将hNav1.4蛋白的羧基端融合荧光蛋白mCherry,利用共聚焦显微镜观察hNav1.4野生型与I1363T突变体蛋白的表达量与分布情况;通过全细胞电生理技术记录野生型与I1363T突变体的稳态激活及快失活参数,并进一步分析野生型与I1363T突变体的窗电流。 结果 hNav1.4 I1363位点在各类钠通道中高度保守。野生型与I1363T突变体均能正常上膜,且表达量无明显差异。野生型与I1363T突变体的50%激活电压V0.5 分别为(-29.08±0.24)mV和(-28.79±0.21)mV,斜率因子k分别为5.06±0.21和4.73±0.18(均P>0.05);野生型与I1363T突变体的50%失活电压V0.5 分别为(-68.03±0.34)mV和(-59.01±0.26)mV,斜率因子k分别为4.55±0.21和5.24±0.23(均P<0.05),I1363T突变体的失活电压向去极化方向移动,且更为平缓。I1363T突变体形成的窗电流大于野生型的窗电流。 结论 I1363T突变会导致hNav1.4慢失活受损,增加肌肉细胞兴奋性,导致肌强直的发生;而增大的窗电流使得钠离子在细胞内缓慢聚集,最终导致细胞兴奋性下降,引发肌无力。   相似文献   
6.
目的:研究miRNA-30b纳米粒对甲状腺未分化癌细胞株TA-K细胞的生物学特性的影响。方法转染不同浓度的miRNA-30b纳米粒进入TA-K细胞中,通过流式法检测TA-K细胞凋亡情况,后通过生物信息学预测miR-NA-30b的生物学靶点,并通过RT-PCR及Western Blot方法验证。结果发现转染了miRNA-30b纳米粒后,TA-K细胞的凋亡显著增加,而生物信息学显示miRNA-30b可靶向作用于Survivin,后经RT-PCR及Western blot 法证实Sur-vivin确实是miRNA-30b的生物学靶点。结论 miRNA-30b可以通过作用Survivin促进TA-K细胞的凋亡,这一现象也为将来甲状腺未分化癌的临床治疗提供了新的思路。  相似文献   
7.
目的观察Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因过表达对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞第二个线粒体来源的半胱氨酸酶的激活剂(Smac)蛋白表达的影响。方法采用脂质体Lipofectamine 2000将携带人Bax基因的过表达质粒转入SH-SY5Y细胞(转染组),同时设空载体组和未转染组。通过G-418筛选后获得转入目的基因的细胞克隆。Hoechst33258染色观察凋亡细胞,免疫印迹法法检测细胞中Bax、Smac蛋白表达,免疫荧光染色检测Bax、Smac蛋白在细胞中的分布。结果转染后用G-418持续筛选2周可获得G418抗性的细胞克隆。Smac主要分布于胞质,Bax主要位于细胞核。转染组SH-SY5Y细胞Bax蛋白表达水平(1.067±0.036)较空载体组(0.436±0.035)和未转染组(0.444±0.046)显著增高(P〈0.05);转染组Smac蛋白表达水平(1.408±0.044)相比空载体组(0.708±0.021)和未转染组(0.748±0.041)显著增高(P〈0.05);空载体和未转染组细胞Bax和Snac蛋白表达均无显著差异(P〉0.05)。转染组较未转染组细胞凋亡率显著增加(P〈0.05)。结论外源性Bax基因转入人神经母细胞瘤细胞中并稳定过表达,能够上调Smac蛋白表达,促进细胞凋亡。  相似文献   
8.
目的 构建婆娑双树基因SALL4的特异性干扰载体并转染儿童睾丸卵黄囊瘤细胞,评价干扰效果,为研究SALL4基因功能提供实验工具.方法 针对不同干扰位点,设计4条特异性siRNA和1条阴性对照序列.构建SALL4干扰质粒载体pGPU6/GFP/Neo-SALL4 shRNA,分空白对照组(Blank组)、阴性对照组(NC组)、单加转染试剂组(MOCK组)、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110),分别转染体外培养的儿童睾丸卵黄囊瘤细胞,采用荧光定量PCR和Western bolt技术比较各组细胞SALL4基因mRNA及蛋白表达情况,筛选出最佳干扰序列.结果 荧光定量PCR结果显示,Blank组、NC组、MOCK组、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-951、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-3110) SALL4基因mRNA的表达水平分别为100%、(118.0±18.0)%、(128.0±15.0)%、(91.0±21.0)%、(25.0±8.0)%、(59.0±11.0)%、(49.0±13.0)%.SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110相比Blank组、NC组、MOCK组mRNA表达下降,差异有统计学意义(F=3.63,P<0.05).Western bolt的检测结果显示Blank组、NC组、MOCK组、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-951、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-3110)SALL4基因蛋白表达水平分别为1、1.1±0.1、1.3±0.3、1.7±0.4、0.2±0.1、0.9±0.2和0.4±0.1.相对Blank组、NC组、MOCK组,SALL4干扰组中SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110均能降低蛋白表达,其中SALL4-homo-951降低最多,差异有统计学意义(F=7.96,P<0.05).结论 SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110均能有效干扰SALL4基因在儿童卵黄囊瘤中的表达,其中SALL4-homo-951干扰效果最佳,可用于下一步实验研究.  相似文献   
9.
ObjectiveTo obtain the bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), complete phenotypic identification and successfully transfect rat BMSCs by recombinant plasmid pEGFP/Ang-1.MethodsBMSCs were isolated from bone marrow using density gradient centrifugation method and adherence screening method, and purified. Then the recombinant plasmid pEGFP/Ang-1 was used to transfect BMSCs and the positive clones were obtained by the screen of G418 and observed under light microscopy inversely. Green fluorescent exhibited by protein was enhanced to measure the change time of the expression amount of Ang-1.ResultsBMSCs cell lines were obtained successfully by adherence screening method and density gradient centrifugation. Ang-1 recombinant plasmid was transfected smoothly into rat BMSCs, which can express Ang-1 for 3 d and decreased after 7 d.ConclusionsAdherence screening method and density gradient centrifugation can be effective methods to obtain BMSCs with high purity and rapid proliferation. Besides, the expression of transfected recombinant plasmid pEGFP/Ang-1 in rat BMSCs is satisfactory.  相似文献   
10.
 目的:构建重组pEGFP-HSP70质粒并观察其在神经干细胞中的表达。方法:采用RT-PCR方法从SD胎鼠肝组织中获取总RNA,扩增出热休克蛋白70(HSP70)基因的全序列cDNA,并克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达载体pEGFP-C2上, 经EcoRⅠ、BamHⅠ酶切及测序分析对重组质粒pEGFP-HSP70进行鉴定。采用Nucleofector转染技术将重组质粒pEGFP-HSP70转染至胎鼠神经干细胞中。结果:(1) 胎鼠HSP70 cDNA序列被正确地克隆到真核表达载体pEGFP-C2中, 成功构建重组大鼠pEGFP-HSP70质粒。荧光强度检测空质粒转染组(pEGFP-C2组)、pEGFP-HSP70组与对照组相比显著升高(P<0.01);pEGFP-HSP70组内24 h的荧光强度与7 d(P<0.05)、14 d(P<0.05)和21 d(P<0.01)相比降低明显。(2) 转染后HSP70的表达在1 d(P<0.05)、7 d(P<0.01)和14 d(P<0.01)与对照组相比均明显升高。结论:神经干细胞可直接作为基因靶细胞, 能有效地表达重组质粒pEGFP-HSP70,且HSP70在神经干细胞中的表达与转染时间密切相关。  相似文献   
设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号