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1.
目的:阐明HSP70对H2O2所致C2C12肌原细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:采用基因瞬间转染技术使细胞HSP70或/和Smac高表达,采用Hoechst 33258染色观察H2O2 (0.5mmol/L)处理转基因C2C12肌原细胞不同时间后细胞核形态学改变并计算凋亡核百分率。DNA抽提及琼脂糖电泳观察凋亡特征性梯带。采用caspase活性定量检测试剂盒及蛋白质印迹分析caspase-9和caspase-3的活化。利用免疫荧光分析HSP70对H2O2所致Smac从线粒体释放的影响。结果:HSP70对H2O2及Smac所致C2C12肌原细胞凋亡具有明显的抑制作用,凋亡核百分率明显降低, DNA电泳未出现明显“梯状”条带;caspase-9和caspase-3的活化明显受到抑制;并进一步发现HSP70可抑制H2O2所致C2C12肌原细胞Smac从线粒体释放。结论:HSP70可通过抑制Smac从线粒体释放来抑制H2O2所致C2C12肌原细胞凋亡。  相似文献
2.
饱和脂肪酸对骨骼肌细胞胰岛素作用的影响及其机制研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:探讨饱和脂肪酸是否造成骨骼肌细胞胰岛素抵抗,并检测核糖体s6蛋白激酶(S6K)是否参与此机制。方法:将棕榈酸偶联到无脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)上,制备成浓度为5mmol/L的棕榈酸储存液,备用。棕榈酸组用0.5mmol/L的棕榈酸孵育16h;溶剂组用含相同浓度的无脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)孵育16h;对照组没有任何处理。用偶联抗体的吸光度分析法测定细胞膜上GLUT4myc的含量,免疫印迹检测胰岛素信号分子胰岛素受体底物(IRS1)、蛋白激酶B(Akt)和S6K的磷酸化水平。结果:与对照组和溶剂组相比,棕榈酸组胰岛素刺激的GLUT4myc转位降低(P〈0.05);Akt的磷酸化水平降低,S6K的磷酸化水平没有变化,IRS1 S636/639的磷酸化水平也没有改变。结论:棕榈酸可导致骨骼肌细胞胰岛素抵抗,其机制可能不涉及S6K。  相似文献
3.
目的:观察蒲黄总黄酮(Pollen Typhae total flavones,PTF)对棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)表达的影响,探讨PTF改善骨骼肌胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的可能机制。 方法:0.25mmol/L棕榈酸培养建立骨骼肌细胞IR模型。根据处理方法不同,设对照组、模型组、核转录因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)抑制剂PDTC组、罗格列酮(rosiglitazone,ROS)组、ROS+PDTC组、PTF组和PTF4-PDTC抑制剂组。处理16h后,^3H-脱氧葡萄糖摄入法观察细胞对葡萄糖的转运率,实时定量多聚酶联反应检测IL-6 mRNA的表达,酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清中IL-6蛋白水平。 结果:0.25mmol/L棕榈酸培养16h,C2C12细胞葡萄糖摄取率下降30.43%,IR模型建立;PTF可使IR模型细胞葡萄糖转运率增加32.39%。IL-6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL-6蛋白水平均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);加入PDTC后,细胞IL-6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL-6蛋白水平上升(P〈0.05)。 结论:PTF通过抑制NF-κB通路而抑制C2C12骨骼肌细胞IL-6 mRNA表达及蛋白分泌,可能是其减轻骨骼肌炎症状态和改善IR的机制之一。  相似文献
4.
目的:研究重组腺病毒(Ad)对骨髓基质干细胞(MSCs)的转染,以及绿色荧光蛋白(GFP)和成肌调节因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表达. 方法:用差速贴壁法体外培养大鼠MSCs,并用流式细胞仪(FCM)检测其表面标志;对构建有绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-GFP)进行扩增和鉴定,并转染MSCs;用RT-PCR检测MyoD和Myogenin在转染后MSCs中的表达;将MSCs与C2C12成肌细胞共培养,诱导前者的分化,并用免疫荧光检测MyoD的表达. 结果:FCM检测证实,在MSCs的表面标志中CD11b和CD45阴性,而CD29和CD44阳性;随着Ad-GFP感染复数(MOI)的增加,转染效率也相应提高,但在MOI大于100后,MSCs开始出现病变;RT-PCR结果提示MyoD和Myogenin在转染后的MSCs中有表达;免疫荧光检测证实诱导后的MSCs可以表达MyoD蛋白. 结论:MSCs可以被Ad-GFP有效转染而表达GFP;同时内源性成肌调节因子的激活,可以促进MSCs的成肌分化.  相似文献
5.
目的:观察脂肪细胞缺氧对骨骼肌细胞胰岛素作用的影响。方法:缺氧(5%CO2、85%N2、10%H2或200μmol/L CoCl2)处理小鼠3T3-L1脂肪细胞,制备条件培养基孵育小鼠骨骼肌细胞。通过对胰岛素信号通路中关键蛋白的磷酸化水平和葡萄糖转运子4(GLUT4)转位得以检测骨骼肌胰岛素作用的改变。结果:缺氧处理的3T3-L1脂肪细胞条件培养基抑制骨骼肌胰岛素信号通路,其中胰岛素受体底物10RS1Set307)磷酸化水平呈显著增高,相反蛋白激酶B(AktSer473)磷酸化水平呈显著下降,最终显著抑制了胰岛素刺激的GLUT4myc转位(p〈0.05)。结论:抑制胰岛素刺激的GLUT4myc转位,其机制与IRSt的Ser307的磷酸化水平升高和Akt的Ser473的磷酸化水平降低有关。  相似文献
6.
目的探讨微小RNA(microRNAs)分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响。方法以C2C12细胞体外成肌分化为模型,Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱,转染DNA/LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究,RT-PCR分析其对分化相关分子的影响。结果成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型,2个分子在分化过程中均表达上调,且它们具有各自的组织分布特点;建立了以DNA/LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台;与对照组比较,抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响。结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化,说明这2个分子对于分化的进程影响不大。  相似文献
7.
目的:研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。方法:根据Myo-statin mRNA序列,选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链,退火后插入pSilencer2.1-U6表达载体,构建3个RNAi阳性质粒:M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer及一个阴性质粒Mc/pSilencer并转染C2C12细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot观察RNAi对C2C12细胞中MyostatinmRNA和蛋白表达的下调作用。结果:构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显著降低C2C12细胞中Myostatin表达量,随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加,Myostatin表达量逐渐降低。结论:成功构建Myostatin RNAi质粒,该质粒能下调目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达量。  相似文献
8.
目的 研究组织工程种子细胞C2C12在微型灌注生物反应器中培养的特点,以期探索一种有效的种子细胞体外培养方法.方法 在自行研制的微型灌注生物反应器中以20%换液量/天、30%换液量/天两种条件进行C2C12细胞培养,通过细胞形态、生长曲线、细胞群体倍增时间及生化代谢离线检测等对培养情况进行研究.结果 微型灌注生物反应器培养较传统的细胞培养瓶培养,培养基使用效率提高;在细胞形态无显著性变化的情况下,细胞群体倍增时间显著缩短.而且,C2C12细胞的生化代谢在20%换液量/天灌注条件下较30%换液量/天的为佳.结论 C2C12细胞的灌注生物反应器培养方式较传统的细胞培养瓶培养方式优越,同时,20%换液量/天的灌注条件较30%换液量/天为佳.该灌注培养体系值得进一步深入研究.  相似文献
9.
目的:探讨乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)对多柔吡星(doxorubicin,DOX)所致肌原细胞毒性的保护作用及其机制。方法:以小鼠C2C12肌原细胞为研究对象,通过基因转染方式调节细胞内ALDH2表达水平,以流式细胞术检测细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖抑制率,化学荧光法检测组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)、4羟壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)蛋白加合物含量及caspase-3/7活性,Western印迹检测Bcl-2,NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2,NOX2)、胞浆调节亚单位p-p47PHOX水平。结果:ALDH2过表达可显著降低DOX所致C2C12细胞凋亡及增殖抑制,而抑制ALDH2的表达则增加DOX对C2C12细胞凋亡诱导及增殖抑制作用;ALDH2过表达可下调p47PHOX磷酸化水平,抑制NOX2活化及ROS生成,而ALDH2低表达则上调p47PHOX磷酸化水平,促进NOX2活化及ROS生成;此外,NOX2活性抑制剂apocynin可抑制p47PHOX磷酸化、ROS生成及caspase-3/7的酶活性,同时增加 ALDH2酶活性及其mRNA水平。结论:DOX所致的肌原细胞毒性与NOX2依赖性细胞氧化应激增强、ALDH2酶活性及表达降低有关,而ALDH2通过抑制上述NOX2信号,减轻细胞凋亡而发挥保护细胞作用。  相似文献
10.
目的 观察苯丙氨酸对小鼠成肌细胞系C2C12葡萄糖摄取能力的影响,以及刺激后细胞内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70S6K信号通路分子的变化。方法 体外培养C2C12细胞,分化诱导为多核的肌管细胞后进行饥饿处理,然后分别用不同浓度苯丙氨酸(1.25、2.5、5、10、20 mmol/L)处理细胞,以KRB平衡液作为对照。通过检测2-NBDG评价细胞葡萄糖摄取能力。用Western blot方法检测细胞内mTOR、p70S6K、胰岛素受体底物(IRS)-1、蛋白激酶B(Akt)的表达情况。结果 与KRB平衡液对照相比,5 mmol/L亮氨酸使C2C12细胞的葡萄糖摄取能力下降了约30%(P=0.001),5 mmol/L苯丙氨酸使C2C12细胞摄取葡萄糖的能力上升了约40%(P<0.01),且苯丙氨酸的这种促进作用随浓度增大有逐渐增强的趋势。苯丙氨酸对细胞内mTOR Ser2448磷酸化水平无明显影响。除1.25 mmol/L外,其它浓度苯丙氨酸均能抑制p70S6K Thr389的表达。亮氨酸使IRS-1 Ser636/639磷酸化水平表达增高(P<0.01),除1.25 mmol/L外,其它浓度的苯丙氨酸均有抑制IRS-1 Ser636/639表达的趋势,但与对照相比差异无统计学意义(P=0.381)。高浓度短时间的苯丙氨酸刺激对C2C12细胞内的Akt Ser473表达无明显影响。结论 苯丙氨酸可能通过减少p70S6K的磷酸化,继而减少p70S6K对IRS-1的刺激作用而使细胞葡萄糖摄取能力增强。但苯丙氨酸对mTOR-p70S6K通路的抑制作用不通过Akt的激活。  相似文献
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