基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。     

新型PARP-1抑制剂的合成及体外抗肿瘤活性研究

目的设计合成2个系列新型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)抑制剂并测定其体外抗肿瘤细胞增殖活性。方法以上市药物为先导化合物,设计合成了系列以6,8-二氟-2-硫代-2,3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮及6-氟-2-硫代-2,3-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4(1H)-酮为母核结构的化合物。采用Alarm Blue法测定目标化合物对体外培养的人源乳腺癌细胞MDA-MB-436的增殖抑制作用。结果与结论合成了10个未见文献报道的新化合物,其结构经~1H-NMR、~(13)C-NMR、质谱确证。初步体外细胞活性结果表明,目标化合物对MDA-MB-436细胞具有一定的增殖抑制作用(IC_(50)值为14.1～1 246 nmol·L~(-1));具有6,8-二氟-2-硫代-2,3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮母核的目标化合物16a～16e对MDA-MB-436细胞的抑制活性普遍高于目标物16f～16j,其中,化合物16c的抑制活性略低于阳性对照药奥拉帕尼;6,8-二氟-2-硫代-2,3-二氢喹唑啉-4(1H)-酮母核具有一定的抑制肿瘤增殖活性,可为化合物进一步的结构修饰提供参考依据。     

实时聚合酶链反应与细菌培养在妊娠晚期孕妇B族链球菌感染诊断中应用价值

目的探讨妊娠晚期孕妇B族链球菌感染(GBS)诊断中实时聚合酶链式反应(PCR)与细菌培养的应用价值。方法回顾性分析2016年10月至2018年9月于我院行产前检查的520例妊娠晚期孕妇临床资料,采用细菌培养与实时PCR技术进行GBS检测,以实时PCR法联合细菌培养判定结果为"金标准",比较2种检测结果及诊断效能。结果 520例妊娠晚期孕妇中,经PCR法或细菌培养判定最终确诊GBS感染者41例,阳性率为7.9%(41/520);细菌培养确诊GBS感染者12例,阳性检出率为2.3%(12/520),实时PCR法确诊GBS感染者39例,阳性检出率为7.5%(39/520),细菌培养与PCR法阳性检出率相比,差异有统计学意义(P<0.05);实时PCR法诊断敏感度、特异度及准确性均高于细菌培养法,差异有统计学意义(P<0.05)。结论与细菌培养相比,实时PCR法在妊娠晚期孕妇GBS感染诊断中具有更高的应用价值,利于为临床干预治疗提供有力依据。     

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒

目的建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法。方法设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系。引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒。将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测。结果显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测。灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒。利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价。结果表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好。结论本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测。     

FAM19A4 基因启动子甲基化检测在 宫颈癌组织中的临床价值

〔摘 要〕 目的：探讨 FAM19A4 基因启动子甲基化检测在宫颈癌组织中的临床价值。 方法：选取 2017 年 1 月至 2018 年 12 月广东医科大学顺德妇女儿童医院病理科采集的宫颈病理样本，其中宫颈癌样本 32 例，高度鳞状上皮内病变（HSIL） 样本 28 例，正常宫颈样本 24 例，通过荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测对三组样本中 FAM19A4 基因启动子甲基化检 出情况进行分析。 结果：不同劳动强度之间并发症种类数量差异具有统计学意义（χ2= 10.84，P = 0.013），劳动强度越重，其并发症种类也越多；不同学历之间的是否使用虚假药物情况差异无统计学意义（χ2 = 1.83，P = 0.40），在用药选择上仍有大多数的患者曾经或正在使用伪劣药品（n = 118）。 结论：FAM19A4 基因启动子 甲基化可能是宫颈癌特异性诊断标志物，可能与宫颈癌的发生以及发展存在一定相关性。     

程序性死亡受体1和程序性死亡受体配体1在非小细胞肺癌组织中的表达情况及临床意义

目的探讨程序性死亡受体1(PD-1)和程序性死亡受体配体1(PD-L1)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达情况及临床意义。方法选择150例NSCLC患者的NSCLC组织及其癌旁组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测两种组织中PD-1 mRNA和PD-L1 mRNA的相对表达量。采用免疫组织化学染色法检测NSCLC组织中PD-1和PD-L1的表达情况,分析PD-1和PD-L1表达情况与患者临床特征的关系。采用流式细胞术检测NSCLC组织和癌旁组织中CD4^+-PD-1、CD8^+-PD-1、CD14^+-PD-L1、CD68^+-PD-L1的表达水平。结果NSCLC组织中PD-1 mRNA和PD-L1 mRNA的相对表达量分别为(5.03±1.92)和(4.95±1.09),分别高于癌旁组织的(1.72±0.81)和(1.25±0.24),差异均有统计学意义(P﹤0.05)。TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移、有远处转移的NSCLC患者NSCLC组织中PD-1和PD-L1的高表达率均明显高于TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期、高+中分化、无淋巴结转移、无远处转移的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。NSCLC组织中CD4^+-PD-1、CD8^+-PD-1、CD14^+-PD-L1、CD68^+-PD-L1的表达水平均明显高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。结论PD-1和PD-L1在NSCLC组织中高表达,可能成为一种新的生物标志物,PD-1/PD-L1信号通路可能参与了NSCLC的免疫逃逸过程,对其逃逸机制进行研究可以为NSCLC患者的临床治疗提供新靶点。     

基于重组酶聚合酶扩增的曼氏血吸虫核酸可视化检测技术的建立及初步评价

目的 结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD)，建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法，并初步评价其检测效能。方法 以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列，利用Primer Primer 5软件结合手工辅助，设计特异性引物和探针并进行筛选，建立曼氏血吸虫核酸LFD-RPA检测方法。制备不同浓度(1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl、0.1 fg/μl)的曼氏血吸虫成虫基因组DNA和含有不同拷贝数浓度(10~5、10~4、10~3、10~2、10~1、10~0、10^-1拷贝/μl)的SmCox1重组质粒DNA，评价所建立方法的敏感度。以曼氏血吸虫成虫、日本血吸虫成虫、埃及血吸虫虫卵、感染曼氏血吸虫双脐螺(阳性双脐螺)和阴性双脐螺、感染日本血吸虫钉螺(阳性钉螺)和阴性钉螺、华支睾吸虫成虫、大片形吸虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA为模板，评价所建立方法的特异性。将30只雌性BALB/c小鼠随机分为40尾感染组、80尾感染组和健康...     

基于线粒体COⅠ基因的广西不同地区福寿螺遗传多态性分析

目的 通过对广西不同地区福寿螺的COⅠ基因进行分析,以了解广西福寿螺种群的遗传多态性。方法 从南宁市横县、桂林市全州县和荔浦县、贺州市富川县、百色市田林县和崇左市凭祥县共计6个县区采集福寿螺样本,提取DNA并进行COⅠ基因的PCR扩增及测序。运用MAGE 7.0将本研究获得的单倍型与GenBank中的福寿螺单倍型使用邻接法构建系统进化树,并计算个体间的遗传距离,分析其遗传多样性。结果 COⅠ基因长度为493 bp,从11个样本鉴定出2种单倍型：单倍型1（Haplotype 1）和单倍型2（Haplotype 2）。其中9个样本为Haplotype 1,分别来源于南宁市横县（2个）、贺州市富川县（1个）、桂林市荔浦县（1个）、百色市田林县（2个）、崇左市凭祥县（3个）,该单倍型与小管福寿螺遗传距离最近,为0.047;2个样本为Haplotype 2,分别源自为南宁市横县和桂林市全州,与孤岛福寿螺遗传距离最近,为0.062。根据上述条件所构建的进化树形成了7个分支,分别为P. canaliculata、P. camena、P. insularum、P. paludosa、P. diffusa、P. haustrum、和外群Pilaconica。Haplotype 1与来自美国夏威夷 （GenBank登录号 EU 523129）的P. canaliculata组成一个分支,Haplotype 2与来自巴西（GenBank登录号EF514942）的P. insularum组成一个分支,且置信值均在98%以上。结论 初步判断广西地区存在小管福寿螺与孤岛福寿螺两种类型的福寿螺,其种群内没有发现遗传分化。     

极速实时荧光聚合酶链反应与常规方法对新型布尼亚病毒检测的评价

目的探讨极速实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光PCR、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和胶体金免疫层析法(gold immunochromatography assay,GICA)4种方法检测新型布尼亚病毒的特异度和灵敏度,为发热伴血小板减少综合征的早期诊断提供依据。方法采集2017年6月1日至9月30日山东大学附属济南市传染病医院86例临床诊断为发热伴血小板减少综合征患者的血清样本,分别应用极速实时荧光PCR、实时荧光PCR、ELISA和GICA 4种方法进行检测。统计学分析采用χ^2检验。结果86份患者血清标本中,极速实时荧光PCR、实时荧光PCR、IgM-ELISA、IgG-ELISA、IgM-GICA、IgG-GICA的新型布尼亚病毒阳性分别为82份(95.34%)、79份(91.86%)、41份(47.67%)、8份(9.3%)、19份(22.09%)和3份(3.49%)。极速实时荧光PCR特异度为100%,灵敏度达到1×103拷贝/mL,3次重复扩增试验显示其Ct值变异系数均<2%。在发热伴血小板减少综合征进展的1期、2期、3期病程中,极速实时荧光PCR的阳性检出率为41份(97.62%)、34份(94.44%)、7份(87.50%),实时荧光PCR的阳性检出率为39份(92.86%)、33份(91.67%)、7份(87.50%),在1期和2期两个病程,极速实时荧光PCR阳性检出率略高;IgM-ELISA阳性检出率从1期(28.57%)到3期(87.50%)显著增高,2期、3期与1期相比,差异均有统计学意义(χ^2=8.347、7.561,均P<0.01);IgM-GICA的阳性检出率从1期(14.29%)到2期(33.33%)也有增高,差异有统计学意义(χ^2=3.962,P<0.05),但与其他方法相比,其检出率偏低。1期,实时荧光PCR阳性检出率显著高于ELISA(IgM和IgG)和GICA(IgM和IgG),差异均有统计学意义(χ^2=33.740、55.080、49.010、64.340,均P<0.01)。2期,实时荧光PCR的阳性检出率高于ELISA(IgM和IgG)和GICA(IgM和IgG),差异均有统计学意义(χ^2=7.700、46.720、23.700、50.630,均P<0.01)。3期,极速实时荧光PCR、实时荧光PCR和IgM-ELISA表现出同样高的阳性检出率,远高于IgG-ELISA和GICA(IgM和IgG)。实时荧光PCR阳性检出率和IgG-ELISA、IgM-GICA、IgG-GICA之间差异均有统计学意义(均χ^2=6.250,P<0.05)。结论极速实时荧光PCR在新型布尼亚病毒的早期检测中有更高的灵敏度和特异度,且重复性好、稳定度高,与传统实时荧光PCR相比大大缩短了扩增时间,对发热伴血小板减少综合征的早期快速诊断具有重要价值。     

基于实时荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量测定方法的开发及比较

目的:对当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的变化情况进行定量分析。方法:建立了实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR),对不同产地、不同收集企业、不同储藏时间当归饮片中金黄色葡萄球菌进行定量分析。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL,正向引物、反向引物(10μmol·L~(-1))各0.8μL,模板/基因组DNA 1μL,双蒸水7.4μL。荧光定量反应条件为①扩增曲线:94℃预变性30 s,94℃变性10 s,60℃退火12 s,72℃延伸30 s,循环45次,72℃单点检测信号;②熔解曲线:72℃开始检测,以0.5℃为台阶温度停留15 s采集荧光。根据Real-time PCR的测定结果,分别从生当归、酒当归和土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法测定,并与Real-time PCR检测结果进行比较。结果:不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量排序为生当归土炒当归酒当归;在不同产地的当归饮片中均以甘肃渭源地区样品所含的金黄色葡萄球菌含量为最低;与零售企业相比,生产销售企业的生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量较低;不同储藏时间对生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量有一定的影响,随储藏时间的增加,金黄色葡萄球菌的含量增加。对部分代表性样品进行检测时发现,平板计数法检测结果数量级较Real-time PCR低3～4个数量级。结论:建立的Real-time PCR的特异性、灵敏度、准确性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的快速、准确定量检测提供有效技术手段。