补肾活血方对血管性痴呆大鼠海马神经细胞自噬的影响＊

目的 探究补肾活血方对血管性痴呆（Vascular Dementia， VD）大鼠模型自噬的影响。方法 52周龄SD雄性大鼠50只，随机分为假手术组（Sham组）、模型组（VD组）、模型+补肾活血方组（BSHX组）、模型+雷帕霉素组（Rap组）和模型+3-甲基腺嘌呤组（3-MA组），每组10只大鼠。除Sham组外其余各组采用两血管阻断法（2-VO）建立VD模型。BSHX组中药灌胃治疗28天；自噬干预组于造模前30 min侧脑室给药。运用Morris水迷宫测试各组大鼠的学习记忆能力；通过尼氏染色和透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）观察大鼠海马区病理形态及自噬变化；采用蛋白免疫印迹（Western blot）法和反转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测大鼠海马Beclin-1、P62以及微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白及mRNA表达情况。结果 与VD组比较，BSHX组大鼠学习记忆能力显著提升（P<0.05），镜下观察BSHX组和3-MA组的细胞形态及数量均有改善，自噬小体鲜见，Beclin-1以及LC3蛋白和mRNA表达水平显著降低（P<0.05），P62蛋白和mRNA表达水平明显升高（P<0.05）结论 补肾活血方可以降低VD大鼠海马区Beclin-1和LC3蛋白及mRNA的表达，提高P62的表达，通过抑制自噬的发生，减轻对神经细胞的损伤，改善学习记忆能力。     

液相色谱串联质谱法检测肝癌细胞N6- 甲基腺嘌呤核苷甲基化水平

目的 建立同时测定N⁶-甲基腺嘌呤核苷(m⁶A)和腺嘌呤核苷(A)的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),检测肝癌细胞m⁶A甲基化水平。方法 HepG₂和L₀₂细胞mRNA经分离、消化为核苷,再经含对乙酰氨基酚为内标的甲醇沉淀处理。色谱柱为Agilent Proshell 120 EC-C₁₈柱,流动相为0.1 g/dl甲酸水-甲醇(82:18),流速0.4 ml/min,柱温为30 ℃。质谱检测模式为多反应监测(DMRM)模式,测定m⁶A和A的浓度,计算细胞m⁶A甲基化水平。 结果 建立的LC-MS/MS法检测m⁶A和A的浓度分别在0.15～50.00 ng/ml和1.50～500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好(r > 0.999),日内、日间精密度均小于15.00 %,准确度为93.67 %～101.10 %,回收率为91.46 %～97.60 %,基质效应为90.26 %～99.27 %,样品稳定性良好。HepG₂和L₀₂细胞m⁶A甲基化水平分别为(0.73 ± 0.11)%和(1.26 ± 0.22)%。结论 该方法准确、快速、稳定和灵敏,可用于检测肝癌细胞m⁶A甲基化水平。     

欧前胡素对Aβ所致AD大鼠模型的神经保护作用

目的探讨欧前胡素对Aβ_(1-40)所致阿尔茨海默病(AD)大鼠模型的神经保护作用及其可能机制。方法将50只SD大鼠随机分为5组(假手术组、模型组、欧前胡素低剂量组、欧前胡素中剂量组、欧前胡素高剂量组),每组各10只。模型组、欧前胡素低剂量组、欧前胡素中剂量组、欧前胡素高剂量组大鼠开颅后,向双侧海马组织海马角1(CA1)区注射Aβ_(1-40)制备AD大鼠模型,假手术组大鼠注射等体积生理盐水。随后,欧前胡素低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠灌胃不同剂量的欧前胡素(25mg·kg~(-1)、50mg·kg~(-1)、100mg·kg~(-1)),模型组和假手术组每日给予等体积生理盐水。干预第17天开始进行Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习和记忆能力。干预第21天后,处死大鼠,取双侧尾状核组织,利用免疫组织化学染色和Highman刚果红染色检测大鼠大脑海马神经元组织学变化,流式细胞术检测大鼠海马组织细胞内活性氧(ROS)含量,氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blotting)检测大鼠海马组织还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶家族成员亚基(gp91~(phox)、p22~(phox)、p47~(phox)、p67~(phox))表达,Western blotting检测p53、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果模型组大鼠寻台时间多于其他各组大鼠,平台滞留时间、穿越平台次数少于其他各组大鼠,欧前胡素干预的大鼠呈剂量依赖性缩短寻台时间,增加平台滞留时间和穿越平台次数,差异分别具有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠海马组织神经元排列混乱,细胞数量少于其他各组大鼠,细胞结构模糊,橘红色淀粉样物质沉积较多,欧前胡素干预的大鼠呈剂量依赖性改善海马组织神经元结构和数量,减少淀粉样物质沉积。模型组大鼠ROS、MDA含量均高于其他各组大鼠,SOD活性低于其他各组大鼠,欧前胡素干预的大鼠呈剂量依赖性降低ROS、MDA含量,升高SOD活性,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠gp91~(phox)、p22~(phox)、p47~(phox)、p67~(phox)表达均高于其他各组大鼠,欧前胡素干预的大鼠呈剂量依赖性降低gp9l~(phox)、p22~(phox)、p47~(phox)、p67~(phox)表达,差异分别具有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠p53、Bax表达高于其他各组大鼠,Bcl-2表达低于其他各组大鼠,欧前胡素干预的大鼠呈剂量依赖性降低p53、Bax表达,增加Bcl-2表达,差异分别有统计学意义(P<0.05)。结论欧前胡素对Aβ所致AD大鼠模型认知障碍具有明显的改善作用,同时具有一定的神经保护作用,其机制可能是通过抑制NADPH氧化酶-ROS-p53线粒体凋亡通路及其下游p53、Bcl-2、Bax蛋白表达,进而减少海马组织神经元细胞氧化应激损伤,起到改善认知障碍和保护神经的作用。     

m6A去甲基化酶ALKBH5与弱精症的相关性研究

目的探究N⁶-甲基腺嘌呤(m⁶A)去甲基化酶ALKBH5与弱精症的相关性。方法收集精液标本30份,包括弱精症患者与健康者精液标本各15份,密度梯度离心纯化精子,使用液相色谱与质谱联用(LC-MS/MS)检测精子RNA的m⁶A水平,使用实时荧光定量PCR法检测ALKBH5相对表达水平。结果弱精症患者m⁶A水平明显高于健康者,ALKBH5相对表达水平低于健康者,差异均有统计学意义(P<0.05)。精子活动度参数相关性分析结果显示,ALKBH5相对表达水平与前向运动精子数和非前向运动精子数呈正相关(r=0.512、0.377,P<0.05),与不动精子数呈负相关(r=-0.497,P<0.05);m⁶A与前向运动精子数和非前向运动精子数呈负相关(r=-0.442、-0.425,P<0.05),与不动精子数呈正相关(r=0.528,P<0.05)。结论在弱精症患者中,m⁶A及其去甲基化酶ALKBH5与精子活动度具有相关性。     

欧前胡素阻断Noxs-ROS通路抑制MKN-45及HT-29细胞增殖活性

目的 探讨欧前胡素对人胃癌细胞(MKN-45)和人结肠癌细胞(HT-29)中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Noxs)-活性氧(ROS)氧化应激通路的作用及对肿瘤细胞增殖活性的影响。方法 MKN-45和HT-29细胞经过不同浓度(3、10、30、100 μmol/L)的欧前胡素及阳性对照二苯基氯化碘盐(DPI)处理后,使用CCK8法检测细胞增殖活性,使用DHE荧光探针检测细胞内ROS水平,使用Western blotting检测细胞内Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5家族蛋白表达。结果 CCK8法结果显示,欧前胡素可浓度相关性地抑制MKN-45和HT-29细胞增殖活性;DHE荧光探针法结果显示,欧前胡素干预可使MKN-45和HT-29细胞荧光强度明显减弱,ROS水平降低;Western blotting结果显示,给予欧前胡素可使MKN-45细胞Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5蛋白表达水平显著降低(P<0.05、0.01、0.001),使HT-29细胞Nox1、Nox2蛋白表达水平显著降低(P<0.05、0.01)。结论 欧前胡素可通过抑制MKN-45和HT-29细胞中Noxs-ROS通路,诱导细胞增殖活性下降,发挥抗肿瘤作用。     

保存时间和温度对血清腺苷脱氨酶活性测定的影响

腺苷脱氨酶(ADA)是腺嘌呤核苷酸代谢的关键酶,能特异性催化腺嘌呤核苷生成次黄嘌呤,最终氧化成尿酸排出体外,是一种与免疫有关的酶,广泛分布于人体组织中,以淋巴样组织含量最高,它与机体的免疫功能有重要关系.2008年5～6月,为确保结果的真实性,我们就全血标本的保存时间和温度对ADA活性检测结果的影响进行探讨.现报告如下.     

虾青素对过氧化氢诱导胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo的影响

目的观察虾青素通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶/活性氧(ROS)信号通路对过氧化氢(H2O2)诱导人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo的影响。方法实验分为空白组、模型组和实验组,每组8个复孔;实验组HTR-8/SVneo细胞预先以10 nmol·L^-1虾青素处理24 h,之后实验组和模型组细胞均以250μmol·L-1H2O2作用24 h;空白组未进行任何药物干预。以噻唑蓝(MTT)法检测各组HTR-8/SVneo细胞增殖情况,以DCF-DA荧光染色检测各组HTR-8/SVneo细胞内ROS水平,检测各组HTR-8/SVneo细胞培养上清中乳酸(LDH)及氧化应激指标含量,以蛋白质印迹法检测各组细胞NADPH氧化酶4(NOX4)、p22phox蛋白表达情况。结果干预后24 h,空白组、模型组及实验组HTR-8/SVneo细胞内ROS荧光强度值分别为2.76±0.43,34.15±2.34,15.61±1.85,LDH分别为(756.24±31.05),(1785.46±34.69),(1235.26±26.75)U·L^-1,超氧化物歧化酶(SOD)分别为(23.56±2.24),(10.04±2.02),(15.16±3.08)U·mg^-1,丙二醛(MDA)分别为(0.46±0.14),(0.96±0.21),(0.68±0.13)U·mg^-1,Nox4蛋白相对表达量分别为0.32±0.04,0.89±0.06,0.64±0.03,p22phox蛋白相对表达量分别为0.15±0.03,0.75±0.04,0.49±0.02,模型组分别与空白组和实验组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论虾青素对H2O2诱导人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo氧化应激损伤具有保护作用,可能与干扰NADPH氧化酶/ROS信号通路活性有关。     

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在脂多糖诱导的小鼠急性心肌损伤组织中的表达及意义

目的探讨还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的非吞噬细胞氧化酶(Nox)家族在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性心肌损伤组织中的表达及意义。方法选取8~10周龄无特定病原体C57/BL6雄性小鼠30只,随机分为对照组和LPS组,每组15只。LPS组小鼠通过腹腔注射大剂量LPS(10 mg/kg)诱导急性心肌损伤模型,对照组腹腔注射等量生理盐水,观察6 h后取材,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Nox、B细胞淋巴瘤/白血病蛋白-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶3(Caspase 3)基因表达,Western blotting检测Nox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2和Caspase 3蛋白表达,免疫组织化学法检测4羟基壬烯醛(4-HNE)表达,末端脱氧核糖核酸转移酶(Td T)介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)切口末端标记技术(TUNEL)法检测心肌组织细胞凋亡,比较两组结果差异。使用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析,两组比较采用t检验。结果相比对照组,LPS组小鼠心肌Nox 2、Nox 4、Bax基因和蛋白以及Caspase 3蛋白表达水平明显升高,Bcl-2基因和蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。免疫组织化学检测结果表明相比对照组,LPS组心肌组织4-HNE表达明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。TUNEL检测结果表明相比对照组,LPS组心肌组织心肌凋亡细胞明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 NADPH氧化酶通过调控氧化应激和细胞凋亡参与急性心肌损伤的发生发展。     

姜黄素对腺嘌呤诱发的肾间质纤维化大鼠血及尿FN、TGF-β1、Col-Ⅳ水平的影响

目的 观察姜黄素对腺嘌呤诱发肾间质纤维化大鼠血、尿纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、胶原蛋白-Ⅳ（Col-Ⅳ）水平的影响.方法 选择雄性Wistar大鼠84只,其中72只采用腺嘌呤混悬液连续灌胃制作腺嘌呤诱发RIF大鼠模型,将其中60只模型制作成功的大鼠随机分为5个组,分别为模型组、尿毒清组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组各12只,另12只正常大鼠作为空白对照组.造模后24d姜黄素低、中、高剂量组大鼠分别给予125、250、500 mg/（kg·d）姜黄素灌胃;尿毒清组大鼠给予尿毒清颗粒3.75 g/（kg·d）灌胃;模型组与空白对照组大鼠给予等量蒸馏水灌胃,共处理60 d.采用双抗体夹心ELISA法检测大鼠血液及尿液中FN、TGF-β1、Col-Ⅳ水平.结果 模型组大鼠血、尿FN、TGF-β1、Col-Ⅳ高于空白对照组（P均＜0.05）,姜黄素各剂量组各指标有所下降,以高剂量组效果最佳,尿毒清组各指标也有所下降,但高于姜黄素高剂量组.结论 姜黄素可能通过下调肾间质纤维化大鼠血、尿FN、TGF-β1、Col-Ⅳ水平干预肾间质纤维化,效果优于尿毒清.