皮肤角朊细胞的三维培养

<正>表皮角朊细胞(keratinocyte,KC)是皮肤创伤后"再上皮化"过程中的主要功能细胞,其增殖和移行是创缘皮肤早期修复的重要生物学过程[1,2]。在体内外环境下探索和检测各种分子类药物、纳米颗粒材料等对KC增殖、移行和分化的功效以及创伤后组织结构和功能的快速修复,是微创治疗的热点研究内容之一[3]。KC的培养作为开展相关研究工作的前提,因其在体外环境贴壁性差,细胞活力低,增     

新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞纯化及培养方法的改进

目的快速纯化大鼠大脑皮质原代星形胶质细胞并进行传代培养。方法取新生2日龄SD大鼠大脑皮层,每2只为一组,将剥除软脑膜的大脑皮层剪碎,添加0. 25%胰蛋白酶-EDTA溶液500μL,37℃消化15 min,将细胞悬液接种于未用多聚赖氨酸处理过的培养瓶中,37℃、5%CO_2细胞培养箱中孵育15 min后,将细胞以5×10~6个/m L接种于L-多聚赖氨酸包被的T75培养瓶中。待细胞长满瓶底,200 r/min 37℃恒温摇18 h,加入1 m L 0. 25%胰蛋白酶,待大部分细胞悬浮后收集细胞。在倒置相差显微镜下对细胞进行形态学观察,胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色法进行星形胶质细胞纯度鉴定,并以MTS法测定传代后细胞增殖活力。结果星形胶质细胞纯度达到(97. 86±0. 91)%,细胞传代后生长情况及增殖活力良好。结论该方法可以高效获取原代及传代的大鼠大脑皮质星形胶质细胞。     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

人脐带来源Muse细胞培养、筛选、鉴定及其移植治疗大鼠脊髓损伤

目的:应用免疫磁珠筛选方法从人脐带华通胶间充质基质细胞中特异性地分选多系分化持续应激细胞(multilineage-differentiating stress-enduring,Muse),并探讨Muse细胞移植治疗大鼠亚急性脊髓损伤的安全性和有效性。方法:将捐赠的脐带华通胶剥离剪碎、胶原酶/胰酶消化、密度梯度离心获得足量间充质基质细胞,应用免疫磁珠特异性筛选SSEA3+的Muse细胞,并使用流式细胞仪及细胞免疫组织化学方法鉴定。体内实验:使用NYU-Ⅲ代大鼠脊髓损伤打击仪建立垂直打击脊髓损伤模型,分为A组(假手术组)、B组(对照组)、C组(Non-Muse细胞移植组)和D组(Muse细胞移植组)。A组大鼠接受标准化的椎板切除手术,但不进行脊髓打击;B、C、D组大鼠均接受标准化的脊髓打击损伤,10 g撞击杆于12.5 mm高度自由落下。脊髓损伤造模后2周进行细胞移植,A组大鼠仅打开伤口不接受移植操作,B、C、D组大鼠分别接受PBS注射、Non-Muse细胞移植、Muse细胞移植,每只大鼠脊髓接受四点注射法,共4×105个细胞。自脊髓损伤造模术后1 d及1、2、3、4、5、6周分别进行大鼠BBB运动功能评分,造模术后6周(即细胞移植后4周)处死动物,用免疫荧光染色研究大鼠脊髓内移植细胞存活、迁移和分化情况。结果:流式细胞仪显示脐带间充质基质细胞CD105+、CD90+和CD73+的百分比均达到99.5%以上,且CD45、CD14表达均低于0.5%,而SSEA3阳性率仅有1.46%。MACS特异性筛选后的细胞群有92.0%同时表达SSEA3和CD105,且免疫组织化学显示SSEA3呈典型的膜染色、形态特别。动物实验:A组动物在各个时间点的BBB评分均为21。单因素方差分析及LSD检验BBB评分情况:细胞移植后6周,C、D组与B组比较差异均有统计学意义(P=0.004,0.002),C组和D组比较差异无统计学意义。进一步组内配对t检验表明,C组第4周与第3周比较差异有统计学意义(P=0.005);D组第4周与第3周比较差异有统计学意义(P=0.016),且第6周与第5周比较差异有统计学意义(P=0.034),说明大鼠运动功能持续改善。脊髓免疫组织化学染色显示,Muse细胞和Non-Muse细胞均由注射点向损伤区迁移,但Muse细胞存活数量明显多于Non-Muse细胞,且在损伤区均匀分布。结论:特异性免疫磁珠筛选是获得高纯度Muse细胞的良好高效的方法,Muse细胞可在大鼠损伤脊髓内大量存活4周并向损伤区迁移,且能持续改善大鼠运动功能,Muse细胞有望成为治疗脊髓损伤的一种新的种子细胞。     

ICSI联合IVM技术在卵巢低反应高龄患者中的应用

目的：探讨胞浆内单精子注射（ICSI）联合未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）技术在卵巢低反应高龄患者中的应用价值。方法：回顾性分析2016年1月—2018年9月于郑州大学第一附属医院生殖医学中心行ICSI助孕治疗81个周期，年龄≥35岁，获卵数≤3个，且卵母细胞均未成熟。按促排卵方案分为微刺激方案组（n=37）和拮抗剂方案组（n=44），统计2组患者基础情况、实验室结果及妊娠结局。结果：①2组患者年龄、不孕时间、基础内分泌、基础窦卵泡数及抗苗勒管激素（AMH）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；②拮抗剂方案组Gn总量较微刺激方案组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；③微刺激方案组与拮抗剂方案组体外培养成熟率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率及优胚率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；④微刺激方案组与拮抗剂方案组的胚胎存活率、种植率和临床妊娠率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：对于卵巢低反应的高龄患者行ICSI联合IVM培养有利于提高卵母细胞成熟率及胚胎利用率，增加妊娠机会，微刺激方案Gn用量少对卵巢低反应患者是经济有效的选择。     

玻璃离子、复合体、复合树脂对人牙髓细胞的细胞毒性试验研究

目的 :研究玻璃离子、复合体、复合树脂牙色材料对体外培养的人牙髓细胞的细胞毒性作用。方法 :采用MTT法测定上述 3种牙色材料的浸渍液对体外培养的人牙髓细胞的细胞毒性。结果 :与对照组相比 ,7d的牙色材料浸渍培养液对体外培养的人牙髓细胞有抑制作用 ,其中复合树脂的抑制人牙髓细胞的增殖有显著性 (P <0 .0 5 ) ;但 3d的浸渍培养液却呈现出不同的细胞毒性作用 :玻璃离子仍有一定的抑制细胞增殖作用 ,复合体基本无作用 ,而复合树脂却有显著的促进细胞增殖作用 (P <0 .0 5 )。结论 :牙色材料的细胞毒性作用与其牙色材料的种类相关。     

猪牙乳头细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:培养新生猪的牙乳头细胞,探讨其传代细胞的生物学特性。方法:选择刚出生1￣3d的新生猪,取出磨牙胚,分离牙乳头,用酶消化法培养猪牙乳头细胞,并用波形丝蛋白和细胞角蛋白鉴定细胞来源。观察细胞的生长规律,通过免疫组化染色检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、牙本质涎蛋白(DSP)等的表达情况。结果:猪牙乳头细胞在体外培养时生长良好,波形丝蛋白染色阳性而细胞角蛋白染色阴性,细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、DSP呈阳性表达。结论:通过酶消化法,可以体外扩增培养猪牙乳头细胞,细胞为间充质来源,其传代细胞在合成胶原及DSP的能力上与体内牙乳头细胞相似,提示猪牙乳头细胞可能具备作为牙髓-牙本质复合体再生研究种子细胞的潜能。     

雌激素对牙周膜细胞生物学性质的影响

目的：明确雌激素对体外牙周膜成纤维细胞迁移、增殖和碱性磷酸酶的影响，以探讨雌激素对牙周组织改建的影响。方法：SD大鼠来源的牙周膜成纤维细胞经传代培养至第四代，建立体外创伤模型，分别在普通培养基和含雌激素的培养基中培养，观察测量细胞迁移情况，运用MTT、酶联检测仪测定细胞的增殖速度，对细胞的ALP进行提取和测定。结果：MTT结果硅示加入雌激素对该细胞的增殖无明显影响；在含雌激素的培养基中成纤维细胞的迁移速度加快；同时牙周膜成纤维细胞的ALP表达娃著提高。结论：雌激素能明显促进牙周膜成纤维细胞的迁移，促进其分化。     

体外培养的神经嵴细胞的定向诱导分化

神经嵴细胞是发育中具有多向分化潜能的干细胞,可向神经元、神经胶质细胞、软骨细胞、平滑肌细胞和黑色素细胞等多方向分化。其分化受到多种因子和化学物质的影响,包括转录因子、生长因子、钙离子浓度和细胞外基质等。     

A系小鼠胚腭突细胞培养及生物学特性的研究

目的:研究A系小鼠胚愕突上皮与间充质细胞在DMEM/F-12培养基中进行原代和传代联合培养及其生物学特性。方法:采用机械分离及胰蛋白酶消化法，简便、准确、快速地获得高成活率的A系小鼠胚愕突细胞，并通过流式细胞仪、相差显微镜、光镜等观察其DNA及蛋白质合成、细胞骨架及其结构。结果:联合培养的A系小鼠胚鳄突细胞中，愕突上皮及间充质细胞均能较好地生长，光镜下观察见上皮型细胞呈多角型，单层铺路石状排列，细胞骨架为栅栏型或巢穴型;间充质细胞呈梭型，单层漩涡状排列，细胞骨架呈梭型、多平行排列的纤维。流式细胞仪检测见细胞DNA及蛋白质含量较丰富，细胞增殖活跃。结论:A系小鼠胚愕突上皮与间充质细胞联合培养模型能较好地保持体内胚愕突的上皮细胞及间充质细胞细胞成分的基本特征。