双重实时荧光PCR快速鉴别人参和西洋参＊

目的 建立一种能够快速鉴定人参和西洋参的双重实时荧光PCR方法。方法 通过对人参属及其近似种基因序列的分析比对，设计特异性的引物探针，建立双重实时荧光PCR检测方法。PCR反应体系为Premix Ex Taq （Probe qPCR） 10 μL，人参上下游引物各0.5 μL，西洋参上下游引物各0.3 μL，人参与西洋参特异性探针各0.4 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水补至20 μL。反应条件为95℃预变性30 s；然后以95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s进行40个循环。应用该方法测试了27份DNA样品，包括7份人参、6份西洋参、4份人参与西洋参混合样、10份其他人参属样品及其他常见中药材样品的DNA，以确定该方法的特异性。将人参与西洋参样品DNA混合后10倍稀释成不同浓度后进行检测，用以确定该方法的灵敏度。结果 人参及西洋参样品均在特定的荧光通道下出现典型的阳性扩增曲线，人参与西洋参混合样品均同时出现两条阳性扩增曲线，其它对照样品及空白对照均没有出现阳性扩增曲线。灵敏度检测结果显示该方法检测人参及西洋参的最低检测限均为2 pg DNA/反应。结论 本实验建立的双重实时荧光PCR方法能够同时快速、准确、灵敏地鉴别出人参和西洋参。     

惠州地区亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性特征分析

目的调查惠州地区人群中亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点多态性的分布特征,为个体化指导育龄妇女增补叶酸及有效地降低新生儿出生缺陷风险提供科学依据。方法收集2017年6月至2019年12月在产前诊断中心门诊就诊的育龄妇女、妊娠期夫妇的外周血样本765例。采用PCR-荧光探针法检测MTHFR基因C677T位点的多态性,并与其他地区或种族人群的数据相比较。结果检出MTHFR基因C677T位点分布特征为CC野生型占54.12% (414例)、CT杂合突变型占38.43% (294例)和TT纯合突变型占7.45% (57例),三种基因型分布比值约为7:5:1。根据年龄以30岁为分界点,将基因型和等位基因分为两组,两年龄组均以野生型为主,依次为杂合突变型和纯合突变型。结论惠州地区MTHFR基因C677T位点的分布特征与其他地区存在差异,具有该地区与种族的特异性。叶酸代谢能力与个体基因型相关,该基因多态性的检测能够科学有效地指导叶酸的补充和监测。     

水蛭分子鉴定方法的研究进展

水蛭基原复杂、市场混乱、传统方法难以有效鉴别,临床用药的安全性无法保障。分子鉴定方法根据生物间的分子特征差异进行鉴定,不受自然环境、生长发育阶段等外部因素影响,具有快速、准确、客观的特点。目前应用于水蛭的分子鉴定方法有:基于核酸的RAPD技术、SSR技术、DNA条形码技术和基于蛋白质的SDS-PAGE技术、同工酶分析技术,本文在简述水蛭不同分子鉴定方法研究进展的基础上,对水蛭不同分子鉴定方法的技术和应用特点进行比较,最后对DNA宏条形码技术、Target-sequencing技术、电化学传感检测技术在水蛭混合物,特别是中成药中水蛭成分的鉴定进行展望,旨在为水蛭鉴定方法的深入研究提供参考和借鉴。     

基于荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中大肠埃希菌数量测定方法开发及比较研究

目的对当归不同炮制品中大肠埃希菌变化进行定量分析。方法建立荧光定量PCR方法,对当归不同炮制品、不同产地、不同收集企业、不同储藏时间的大肠埃希菌进行定量分析。结果不同炮制品中大肠埃希菌数量变化为生当归土炒当归酒当归;在不同产地的当归中以甘肃岷县地区所含的大肠埃希菌的数量最少;与零售企业相比,生产销售企业的当归和酒当归中大肠埃希菌的数量较少;不同储藏时间对当归和酒当归中大肠埃希菌数量有一定影响,随储藏时间的增加,大肠埃希菌的数量也在增加。对部分代表性样品进行平板计数法与荧光定量PCR法比较时发现,平板计数法结果多呈阴性,荧光定量PCR结果均呈阳性。结论所建立的荧光定量PCR法特异性、灵敏度、可靠性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中大肠埃希菌的快速、准确定量检测提供有效手段。     

RNA恒温扩增-金探针层析法在肺炎支原体检测中的应用

目的:比较RNA恒温扩增-金探针层析法和荧光PCR法检测肺炎支原体的结果,探讨前者在肺炎支原体检测中的临床应用价值。方法:采用整体抽样的方法收集344例临床咽拭子标本,分别用RNA恒温扩增-金探针层析法和荧光PCR法进行检测,以荧光PCR法所得结果为参比,对检测结果进行统计分析。结果:RNA恒温扩增-金探针层析法阳性检出率13. 08%,荧光PCR法阳性检出率12. 79%,差异无统计学意义(χ2=0. 012 9,P>0. 05)。RNA恒温扩增-金探针层析法与荧光PCR法相比阳性符合率为97. 73%,阴性符合率为99. 33%,总符合率为99. 13%,一致性系数(Kappa值)为0. 961 3。结论:二者总符合率高,有相同的检出能力。在此基础上,RNA恒温扩增-金探针层析法作为一种创新方法,还具有操作简单、设备要求不高、结果判读明了等优点,因此该方法在肺炎支原体检测中有很强的临床应用价值。     

基于实时荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量测定方法的开发及比较

目的:对当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的变化情况进行定量分析。方法:建立了实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR),对不同产地、不同收集企业、不同储藏时间当归饮片中金黄色葡萄球菌进行定量分析。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL,正向引物、反向引物(10μmol·L~(-1))各0.8μL,模板/基因组DNA 1μL,双蒸水7.4μL。荧光定量反应条件为①扩增曲线:94℃预变性30 s,94℃变性10 s,60℃退火12 s,72℃延伸30 s,循环45次,72℃单点检测信号;②熔解曲线:72℃开始检测,以0.5℃为台阶温度停留15 s采集荧光。根据Real-time PCR的测定结果,分别从生当归、酒当归和土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法测定,并与Real-time PCR检测结果进行比较。结果:不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量排序为生当归土炒当归酒当归;在不同产地的当归饮片中均以甘肃渭源地区样品所含的金黄色葡萄球菌含量为最低;与零售企业相比,生产销售企业的生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量较低;不同储藏时间对生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量有一定的影响,随储藏时间的增加,金黄色葡萄球菌的含量增加。对部分代表性样品进行检测时发现,平板计数法检测结果数量级较Real-time PCR低3～4个数量级。结论:建立的Real-time PCR的特异性、灵敏度、准确性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的快速、准确定量检测提供有效技术手段。     

丽水市十三项呼吸道病原体感染情况及特点分析北大核心CSCD

目的了解丽水市呼吸道病原体感染情况及流行病学特征,为呼吸道传染病诊疗与防控提供科学依据。方法回顾性分析2020年3月至2021年12月丽水市人民医院收治的4035例呼吸道感染患者13项呼吸道病原体PCR毛细电泳核酸检测结果,并分析病原体感染分布特征。结果呼吸道病原体感染患者阳性检出率为32.24%(1301/4035),检出率前5位分别是HRV(16.60%)、HRSV(7.09%)、HPIV(2.87%)、HMPV(2.21%)、HADV(1.96%)。混合感染阳性占比为7.61%(99/1301),Boca病毒(76.0%)与Ch(46.15%)易与其它病原体形成混合感染。不同性别呼吸道病原体感染率差异无统计学意义(P>0.05)。虽然不同季节呼吸道病原体整体感染率差异无统计学意义(P>0.05),但HRV好发于春秋两季,而HPIV在春秋两季感染率较低,春季HRSV感染率较低,HADV在夏秋两季感染率较低,HMPV在冬季较为流行。未成年人呼吸道病原体感染率较高,HRSV、HRV、HPIV、HADV和Boca主要发生于未成年人组,InfB和HMPV在未成年和青年人群感染率都较高。结论未成年人群是呼吸道病原体易感人群,应加强未成年人呼吸道传染病防控。