变形链球菌葡糖基转移酶gtfB／CAT真核表达质粒的构建及表达

目的:构建变形链球菌葡糖基转移酶催化区(gtfB/CAT)真核表达质粒(pVAX1-gtfB/CAT),并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达.方法:通过基因重组技术构建pVAX1-gtfB/CAT;通过脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,然后以免疫组化SABC法检测其在细胞中的表达.结果:pVAX1-gtfB/CAT经酶切分析证实携带gtfB/CAT片段;pVAX1-gtfB/CAT转染的细胞胞质呈褐色染色,pVAX1空质粒转染的细胞胞质中无着色.结论:成功构建防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白.     

融合防龋DNA疫苗pGLUA-P的构建及其细胞表达研究

目的 将变形链球菌（Streptococcus mutans)表面蛋白PAc编码A区和P区（A－P）的序列克隆到真核载体pGLU中，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗，并检测其在原核细胞和真核细胞中的表达。方法 将pCIA-P质粒中A－P片段序列与pGLU质粒连接，构建出GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。将pGLUA-P转化大肠杆菌BL21（DE3），以SDS－PAGE电泳鉴定目的蛋白GLUA－P的表达。通过脂质体将pGLUA-P转染大鼠原代肌母细胞，以免疫组织化学检测GLUA－P的表达。结果 GTF－PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P经酶切分析证实携带GLU和A－P片段。pGLUA-P转化的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白。pGLUA-P转染的大鼠原代肌母细胞中可检测到融合蛋白的表达。结论 成功地构建了融合防龋DNA疫苗pGLUA-P，所携带的基因序列正确，能够在原核和真核细胞中表达正确的融合蛋白。     

异质性胞核核糖核蛋白、小核核糖核蛋白与自身免疫性疾病

在真核细胞,异质性胞核核糖核蛋白(heterogenous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)与小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoprotein,snRNP)共同参与mRNA成熟的过程.研究发现,hnRNP复合体家族至少包含20种以上功能各异的RNA结合蛋白,它们的分子大小及等电点均不相同.     

p70S6K1及4E-BP1蛋白在结直肠癌中的作用

磷脂酰肌醇激酶3-蛋白激酶 B-雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在结直肠癌的发生、发展中发挥重要的作用。mTORC1下游靶点是核糖体 S6蛋白激酶1（p70S6K1）和真核翻译起始因子-4E结合蛋白1（4EBP1）,两者在蛋白质合成中起主要的调节作用。结直肠癌中 p70S6K1及4EBP1的异常表达成为关注的焦点。     

真核细胞翻译起始因子4E 对鼻咽癌侵袭转移的作用

目的：分析真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）对鼻咽癌侵袭转移的促进作用，为临床评估鼻咽癌侵袭转移提供新的筛查靶点。方法利用细胞试验研究eIF4E在鼻咽癌细胞中高表达的机制，和被人潜伏膜蛋白（LM P1）诱导转录活化的机制，以及转录活化对鼻咽癌细胞侵袭转移的影响。结果 eIF4E可以被LM P1诱导转录活化，vector组eIF4E的mRNA表达水平与MOCK组间差异无统计学意义（P＞0．05）。LMP1组与vector组比较，eIF4E的mRNA表达水平显著上升，差异有统计学意义（P＜0．05）。经灰度分析，MOCK组与vector组eIF4E的mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0．05），LMP1组为vector组的2．173倍，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 eIF4E经LM P1诱导转录活化后，可促进鼻咽癌的侵袭转移，提示LM P1是致癌效应信号传递的一个关键节点，可以作为临床评估鼻咽癌侵袭转移的一个新的筛查靶点。     

真核细胞翻译起始因子-4E在食管癌变过程中的表达变化及意义

目的研究真核细胞翻译起始因子-4E(e IF-4E)在正常食管上皮及不同食管病变组织中的表达及其与血管内皮生长因子(VEGF)的关系。方法从新乡医学院第一附属医院病理科2014年3月至2016年3月胃镜活组织检查存档标本中选取正常食管断端30例、非典型增生32例、原位癌20例和浸润癌117例。采用免疫组织化学法检测e IF-4E、VEGF在各种食管组织中的表达,并分析二者之间的相关性。结果正常食管上皮、非典型增生、原位癌和浸润癌组织中e IF-4E阳性表达率分别为0.0%(0/30)、9.4%(3/32)、45.0%(9/20)和80.3%(94/117)。正常食管上皮与非典型增生组织中e IF-4E阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05);其余各组织之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。117例浸润癌组织中,发生转移和未发生转移癌组织中e IF-4E阳性表达率分别为93.2%(55/59)、67.2%(39/58),发生转移癌组织中的阳性表达率显著高于未发生转移癌组织(P<0.05);浸润至浅肌层、深肌层和外膜的癌组织中e IF-4E阳性表达率分别为70.0%(28/40)、73.8%(31/42)、100.0%(35/35),浸润至浅肌层与深肌层的癌组织中e IF-4E阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05),浸润至浅肌层和深肌层的食管癌组织中e IF-4E阳性表达率明显低于浸润至外膜的食管癌组织(P<0.05)。食管浸润癌组织中e IF-4E表达与VEGF表达呈正相关(χ~2=51.460,P<0.05)。结论 e IF-4E在正常食管上皮癌变及癌变后的浸润与转移中发挥着重要作用;e IF-4E在食管癌组织中的表达与VEGF有相关性。     

大鼠肝细胞生长因子与肝再生增强因子融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

Objective To construct and identify an eukaryotic expression plasmid containing rat hepatocyte growth factor(rHGF)gene and rat augmenter of liver regeneration(rALR)gene,so that to provide experimental basis for developing new treatments of hepatic fibrosis.Methods The gene fragments of rHGF and rALR were amplified from recombinant prokaryotic plasmid pUC18-rHGF and pUC18-rALR by polymerase chain reaction(PCR),respectively,then were spliced by overlap extension PCR with a linker,and the fusion gene rHGF-linker-rALR was constructed.The fusion gene was directionally inserted into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 between restriction sites of Kpn Ⅰ and Xba Ⅰ to construct the recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR,and the new constructed recombinant plasmid was identified by double restriction digestion and DNA sequencing.Results DNA fragments of 2200 bp and 400 bp were observed after the electrophoresis of products amplified from recombinant prokaryotic plasmid pUC18-rHGF and pUC18-rALR,respectively,which was consistent with the theoretical value.The electrophoresis of fusion gene rHGF-linker-rALR obtained by overlap extension PCR technique showed only a 2 600 bp DNA fragment,which was in accordance with the expected value.Electrophoresis of products of pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR digested with Kpn Ⅰ and Xba Ⅰ showed two DNA fragments with 2600 bp and 5400 bp,which were both consistent with the expected value.The sequences were confirmed correctly by DNA sequencing.Conclusion The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR is successfully constructed,which provides experimental basis for developing gene therapy of hepatic fibrosis.     

汉坦病毒汉城型浙37株G1、G2包膜糖蛋白基因重组体的构建及在真核细胞中的表达

目的：构建汉坦病毒浙37（Z37）株包膜糖蛋白基因G1、G2真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：根据Z37M基因序列设计6条引物，分别以质粒pGEMZ37,pCUMZ37为模板，通过聚合酶链反应（PCR）获得G1及G2片段。将G1、G2片段经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切片插入至真核表达载体pcDNA3.1( ），经酶切鉴定，并测序证实。以磷酸钙沉淀法分别将重组质粒转染COS－7细胞，用间接免疫荧光法（IFA）检测瞬时表达的蛋白。结果：获得分别含有编码汉坦病毒（HV）Z37株包膜糖蛋白G1、G2基因的重组质粒pcDNA3.1-g1,pcDNA3.1-G2；在转染的COS－7细胞内，用IFA可检测到细胞内有特异性荧光。结论：成功地构建了HV Z37株包膜糖蛋白G1、G2基因真核表达载体，并可在COS－7细胞中瞬时表达。     

2-氨基嘌呤对小鼠的毒理学研究

目的:2-氨基嘌呤(2-Aminopurine,2-AP)是一种真核生物翻译启动因子2α(eukaryotic translation initiation factor-2α,e IF-2α)激酶的抑制剂。细胞水平的研究发现2-AP能够抑制病毒的复制及泡沫细胞的形成,因此有可能作为药物用于治疗或预防病毒感染和动脉粥样硬化相关的心血管疾病,如缺血性心脏病和中风。这里我们研究了2-AP对小鼠的毒性作用。方法:C57BL野生型小鼠在30d内每两天2-AP灌胃1次,剂量为200、300或400mg/kg体重。结果:所有给药400mg/kg体重的小鼠在14d内全数死亡。解剖后发现在小鼠胃内积累了大量未消化的食物,但其他器官,如心、肾、肝、肺及消化道则没有表现出明显的病理变化。给药剂量为300mg/kg体重的小鼠没有死亡,但与对照组相比,小鼠的生长速度迟缓。给药200mg/kg体重的小鼠,食物摄入量、血糖水平以及体重并没有减少,死亡率与对照组相比也没有增加。结论:小鼠隔日1次灌胃给药2-AP的剂量应该≤200mg/kg。     

真核翻译起始因子4E对宫颈癌细胞增殖迁移的作用研究

目的：探讨eIF4E对宫颈癌细胞增殖迁移的调控作用。方法：eIF4E表达质粒转染C33a细胞。 Real-time PCR检测eIF4E mRNA表达,CCK-8法、Transwell实验分别检测细胞增殖以及迁移。结果：eIF4E质粒转染C33a细胞后,eIF4E的mRNA表达水平升高约52%（P＜0.01）,细胞增殖中与NC组相比,eIF4E组细胞增殖在24h、48h、72h分别增加了20.2%、67.7%、54.3%（P＜0.05）。而细胞侵袭数目在24h、48h、72h分别增加了23.7%、35.7%、42.7%（P＜0.05）。结论：eIF4E能够促进宫颈癌C33a的增殖侵袭能力,是宫颈癌防治的潜在靶点。