雌性Fmr1基因敲除小鼠生殖功能的初步研究

目的初步研究敲除Fm r1基因对动物生殖功能的影响。方法6~8周龄雌性Fm r1基因敲除小鼠24只,分为对照组、春季超排组和冬季超排组,每组8只,进行超排,用放射免疫分析法测定超排前后血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、促黄体生成素(LH)和促卵泡生成素(FSH)含量,以及不同季节的超排卵数,并进行统计学处理和分析。结果超排后小鼠血清中P和LH含量明显增加[(24.43±13.33)比(1.60±0.46);(173.86±112.09)比(0.36±0.23),P<0.01]。与冬季(11.44±5.93)比较,春季(37.25±13.91)的超排卵数明显增加(P<0.01)。结论雌性Fm r1基因敲除小鼠的生殖系统功能没有明显异常。与正常小鼠一样,Frm 1基因敲除小鼠机体内P和LH的分泌随动物的生理发育时期而变化。其超排效果随季节而有显著不同。     

Cx43在造血调控及重建中的作用

目的:采用条件性基因敲除技术构建造血系统间隙连接蛋白43(Cx43)基因敲除(Cx43~(-/-))小鼠模型,并探讨Cx43在维持造血细胞自我更新及功能稳定中的作用。方法:将引进的2对转基因小鼠Cx43 loxP/loxP和Lyz-Cre/+杂交,选取F1雌性子代Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+与雄性Cx43 loxP/loxP合笼回配,提取所获得子代小鼠鼠尾组织基因组DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,RT-PCR方法筛选Cx43~(-/-)小鼠,同时分析小鼠不同器官中Cx43基因的表达差异;该类小鼠经5-氟尿嘧啶(5-FU;125 mg/kg)处理,在化疗前及化疗后第5、10和15天经眼球取血分析其血象变化。Cx43~(-/-)及Cx43~(+/+)小鼠予7.5 Gy(~(60)Co-γ)的致死量照射,剂量率1 Gy/min,照射后6 h分别给予事先准备就序的骨髓细胞,每只3×10~6细胞于尾静脉注入,2周后处死小鼠检测造血是否重建:分离股骨切片后,收集骨髓细胞进行细胞表型分析(选用的单抗为CD45R、Gr-1、CD4、 CD8a、TCRαβ、Mac-1、抗sIgM、TER119、Sca-1及CD117);同时进行体外造血细胞集落实验观察造血细胞的体外增殖能力。结果:本研究通过2种转基因小鼠间杂交和回交,成功获得造血系统选择性Cx43基因敲除小鼠;该类小鼠骨髓及外周血细胞无Cx43表达,参与造血的组织,如肝脏和脾脏中Cx43表达也显著下调(P0.01),而心脏和肾脏的Cx43表达则无影响,小鼠成年后外周血象分析并无明显异常,但应急代偿能力下降,经5-FU处理后,其造血功能恢复显著减缓,处理15 d后,Cx43~(+/+)小鼠造血功能已接近正常水平,而Cx43~(-/-)小鼠仍无明显的恢复迹象,血红蛋白、白细胞及血小板仍处低位,2者差别有统计学显著性(P0.01);体外集落试验也证实Cx43~(-/-)小鼠造血干/祖细胞的增殖能力下降,其CFU-GM或CFU-E集落数均明显少于Cx43~(+/+)小鼠(P0.01),但流式细胞术结果显示,Cx43~(-/-)小鼠骨髓中Lin~-/c-Kit~+/Sca-1~+细胞亚群数量与Cx43~(+/+)小鼠相比差异并无统计学显著性;Cx43~(-/-)小鼠在化疗或移植后其骨髓造血功能重建均延迟,且化疗15 d后骨髓切片及涂片均证实其骨髓中造血细胞增生程度明显降低,脂肪组织显著增多,而且T、B细胞发育也有异常。此外,其外周血中CD4~+CD8~+细胞比例比野生型小鼠增多(P0.05),但CD4~+T细胞显著减少(P0.01),尤其是TCRαβ亚群细胞减少最为明显(P0.01)。同样,Cx43~(-/-)小鼠外周血中CD45R~+sIgM~-细胞亚群比例与野生型小鼠相比显著减少(P0.01)。结论:骨髓中Cx43基因表达在造血干/祖细胞发育(尤其是应急状态时)具重要作用,敲除Cx43基因后造血干/祖细胞增殖减缓,造血及免疫重建功能受损。     

载脂蛋白E基因敲除小鼠在动脉粥样硬化研究中的应用

载脂蛋白E基因敲除小鼠是目前在动脉粥样硬化 (AS)研究领域中应用最多的基因工程动物。参考国内外应用载脂蛋白E基因敲除小鼠研究AS的有关文献 ,就其AS病灶形成的规律及形态学改变 ,有氧运动和饮食对该小鼠AS病灶的影响 ,关于调脂药物和其它药物研究情况 ,骨髓移植和基因治疗对该种小鼠AS病灶的影响等方面作一综述 ,以期将这种基因工程小鼠动物模型更广泛地应用于中西医药研究     

先天性心脏病发生机制的体内实验研究方法

对于先天性心脏病的研究需依赖于体内实验,而体内实验的成功必须借助于准确、有效的实验方法.近年来,随着新理论的发现,不断有新的实验方法应用于体内实验.该文就近年常用的及新出现的应用于研究先天性心脏病发生机制的体内实验方法作一综述.     

Fmr1基因敲除小鼠血清雌性激素含量的比较研究

目的 测定不同周龄和超排前后雌性Fmr1基因敲除FVB小鼠和背景FVB小鼠血清生殖激素雌二醇(E2)、孕酮(P)、促黄体生成激素(LH)和促卵泡生成激素(FSH)含量,比较不同周龄和不同状态下敲除基因动物的血清性激素水平,研究敲除基因对动物的发育和生殖生理等方面的影响.方法 用放射免疫分析法测定上述动物不同周龄和超排前后血清E2、P、LH和FSH的含量,测定Fmr1基因敲除小鼠不同周龄时的超排卵数,进行统计学分析.结果 6周龄的雌性Fmr1基因敲除小鼠与FVB小鼠比较,LH、FSH值差异无显著性(P＞0.05),E2的P值差异有显著性(P＜0.05).10周龄的两组动物间血清生殖激素水平和超排卵数均差异无显著性(P＞0.05).10周龄Fmr1基因敲除小鼠的超排卵数与6周龄动物比较差异有显著性(P＜0.05).结论 敲除Fmr1基因对动物雌性激素的分泌有影响,该基因与动物的生殖生理有一定的关联.     

铜绿假单胞菌感应分子对照质粒及整合突变株的构建

目的 研究细胞间信息传递机制之一假单胞菌喹诺酮信号(PQS)在铜绿假单胞菌发病机制中的作用.方法 基于基因融合分析在转录研究中的实用性,构建了两种PQS相关对照质粒和整合突变株.一种是酶切质粒pYHP441获得pqsA'-lacZ片段后,亚克隆入质粒miniCTX-1中,构建成pqsA'的阳性表达质粒,随后将构建的质粒,通过双亲交配过程整合入野生型铜绿假单胞菌株PAO-1染色体组中;另一种是通过点特异插入诱变策略,将四环素基因盒插入启动子pqsD和pqsE之间,构建的阴性质粒转化入大肠杆菌S17-1株后,和上述pqsA'阳性表达突变株进行双亲交配过程.结果 针对今后PQS的相关研究,构建得到稳定表达PQS的质粒和阳性突变株作为阳性对照.构建获得pqsA-E启动子敲除质粒和相应PQS表达受阻的整合突变株作为阴性对照.结论 两种质粒和整合突变株的构建成功,使得PQS的相关研究结论具有客观性、精确性和有效性.     

食管癌细胞Eca9706 DNA聚合酶β基因敲除载体的构建

目的构建食管癌细胞Eca9706 DNA聚合酶β（DNA polβ）基因敲除载体,为DNA polβ基因敲除奠定基础。方法应用体细胞基因敲除技术的方法和原理,根据DNA polβ基因序列,设计并合成2对特异性引物（UP1/UP2和DOWN1/DOWN2）,通过PCR扩增获得上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN）,其中上游同源序列长1 268 bp,下游同源序列长2 150 bp,将其插入骨架载体pcDNA3.1,从而构建了DNA polβ基因敲除载体pOUT-polβ,最后用PCR、酶切和测序进行鉴定。结果经过PCR筛选,限制性酶切及DNA测序鉴定,证实上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN）2个片段插入正确。结论通过本研究所述方法,成功构建了用于食管癌细胞Eca9706 DNA polβ基因敲除载体pOUT-polβ。     

利用单克隆抗体特异性敲除技术解析中药药效物质基础的新方法

中药药效物质基础研究是实现中药现代化的关键问题之一。作者将小分子单克隆抗体技术引入中药药效物质基础研究,利用中药活性成分的单克隆抗体制备相应的免疫亲和色谱柱,实现从药材或复方中特异性地"敲除"该化合物,而"原样"保留其他成分在量和比例关系上不变,通过药理药效的比较研究,来明确揭示该成分与整体中药或复方功能主治的关联度。利用单克隆抗体特异性敲除技术解析中药药效物质基础,是符合中药自身特点的药效物质基础研究新方法,获得的研究结果不仅有助于从全新的角度理解物质基础,而且有助于理解中药单味药内部,或复方药味之间"配伍"的现代科学意义。     

主动外排泵外膜蛋白编码基因hefA在幽门螺杆菌多重耐药中的重要作用

目的: 研究幽门螺杆菌(H pylori)分离株的多重耐药机制.方法:用氯霉素对临床分离株H pylori和标准株H pylori进行体外诱导,琼脂稀释法测定诱导后菌株对甲硝唑、四环素、琥乙红霉素、环丙沙星和青霉素G的耐药性,从而筛选出多重耐药株;实时定量PCR检测多重耐药株和敏感株中编码主动外排泵外膜蛋白的结构基因hefA的mRNA水平.通过构建hefA基因敲除株,测定敲除前后菌株对10种抗生素的敏感性.PCR扩增20株H pylori临床分离株主动外排泵结构基因hefA和hefC.结果:经氯霉素诱导后,筛选出的耐药菌株均表现出相似的多重耐药性,6株多重耐药株hefA基因mRNA水平显著高于敏感株(5.8466±2.9370 vs 2.6356±1.7245,P=0.033);成功构建了HefA基因敲除株(△HpLZ1026),△HpLZ1026对4种抗生素的敏感性明显增加;所有20株临床分离株中均检测出hefA和hefC基因,未发现hefABC基因缺失株.结论:主动外排系统hefA基因高表达导致体外人工诱导H pylori多重耐药的产生;hefABC基因在H pylori中普遍存在,且在H pylori多药耐药机制中起重要作用.     

敲低和敲除OPTN基因SKOV3细胞的构建及其对抗癌药物敏感性的影响

目的利用RNA干扰技术建立稳定敲低OPTN蛋白的人SKOV3细胞株和利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立稳定敲除OPTN蛋白的人SKOV3细胞株,并研究降低OPTN基因表达对细胞抗癌药物敏感性的影响。方法针对OPTN基因设计shRNA和sgRNA的序列,并与慢病毒载体质粒pGPU 6_GFP_Neo和敲除质粒PX 459载体连接产生重组载体。并将重组的质粒测序验证,将测序成功的重组质粒载体与包装质粒(psPAX 2、pMD 2.G)共转染293 T细胞进行病毒包装,收集病毒上清液并感染SKOV3细胞,获得稳定敲低和稳定敲除OPTN基因的SKOV3细胞株。RT-PCR检测敲低组OPTN基因的表达的变化,PCR检测敲除组的基因组DNA的变化,Western blot法分析检测OPTN蛋白的表达情况。MTT法检测DDP对卵巢癌细胞增殖的影响,qRT-PCR检测caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA的表达情况,Western blot检测caspase3、Bax、和Bcl-2蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒载体和基因敲除载体,在SKOV...