链球菌gordonii FSS2 N-乙酰氨基葡糖苷酶基因的克隆和表达

目的 :N -乙酰氨基葡糖苷酶 (N -acetylglucosaminidase)是链球菌gordonii六种胞外糖苷酶之一。为研究该酶 ,克隆和表达该基因片段。方法 :将链球菌gordoniiFSS2染色体DNA分离提纯 ,用限制性内切酶Sau 3AI不完全酶切 ,产生长度不等的随机片段 ,琼脂糖凝胶电泳分离和回收 2 - 8kpb的随机片段 ,然后与BamHI线性化及 5’端脱磷处理的载体pUC 18连接 ,转化大肠杆菌XL1-Blue;β—半乳糖苷酶筛选系统及酶切 ,检测插入片段。根据N -乙酰氨基葡糖苷酶与特异人工底物X -GlucNac反应 ,有色物质X被释放原理 ,筛选表达克隆。结果 :共有 6×10 6个转化子 ,约 5 0 %转化子含有插入片段 ;检测到 8个N—乙酰氨基葡糖苷酶表达克隆。结论 :所构建的基因组文库具有完整性 ,该基因在大肠杆菌XL1-Blue中成功表达。     

蜘蛛拖丝蛋白基因亚克隆与全序列测序对其结构与功能了解的意义

目的:了解蜘蛛拖丝蛋白基因的结构,利用基因工程技术制备人工蛛丝纤维,开发具有独特的机械特性和良好生物相容性的新型蜘蛛丝纤维生物材料。方法:通过结合限制性内切酶消化和超声波机械剪切蜘蛛拖丝蛋白全基因克隆ScosDS-1DNA,制备的DNA片段分别与载体pUC19连接,构建了4个拖丝蛋白基因亚克隆文库。筛选、鉴定亚克隆文库的重组子,选取大小合适的重组子进行测序。结果:筛选的重组子数目超过400个,成功完成的测序反应数近500次,总读长已为ScosDS-1全长的5倍。结论:初步进行了ScosDS-1全序列拼接,以进一步了解拖丝蛋白基因的结构与功能,为合理的设计化合成基因,人工仿制蛛丝纤维奠定了基础。     

利用果蝇转座子作载体构建土垢分枝杆菌变异基因文库的研究

目的　利用果蝇mariner转座子作为载体构建土垢分枝杆菌随机变异基因文库以筛选影响脂肪酸代谢的基因。　方法　将果蝇转座子mos1的末端反向重复序列置于卡那霉素抗性基因两侧 ,并将此种基因插入到M2 72B载体 ,用此载体转化土垢分枝杆菌 ,用Southernblot验证外源基因的插入。将变异的基因克隆在不同碳源的培养基上培养 ,筛选只在软脂酸上生长的菌落。　结果　初筛了 4 6 8个菌落 ,有 5个不能在软脂酸上生长 ,其中 2个在ICL基因上发生变异 ,3个在PCKA基因上发生变异。ICL为乙醛酸旁路所必须 ,PCKA编码糖异生的关键酶。　结论　研究证明该转座子载体用于基因变异有效 ,变异筛选分枝杆菌中与脂肪酸代谢的基因可行。     

恶性疟原虫染色体基因文库的构建

恶性疟原虫FCC1/HN株DNA经Bam HI部分消化后,取17-22kb片段插入到载体EMBL_4DNA左右臂之间,经体外包装后,感染P_2溶源菌E.coli L_(95),建成基因文库,使原虫基因组中的每一段DNA序列均有99％的几率克隆到文库中。通过原位杂交,筛出了含有重复序列的特异克隆,证明该库稳定而有效。     

血吸虫感染抗性人血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的分析血吸虫感染抗性人血清中起免疫保护作用抗体针对的日本血吸虫蛋白抗原谱,为日本血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原分子。方法采集血吸虫流行病区感染抗性人血清,免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对获得的阳性克隆核苷酸进行序列分析,并利用软件对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果共筛选出29个持续阳性克隆,对其进行测序,获得25个基因,包括5种已知基因(其中日本血吸虫肌球蛋白12个、丝氨酸蛋白酶抑制剂2个、细胞色素b1个、延伸因子1-α1个和线粒体编码区1个)和5个未知基因,软件分析显示不同抗原分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能编码潜在的日本血吸虫病疫苗分子,其中日本血吸虫肌球蛋白为主要抗感染蛋白分子。     

利用抑制性消减杂交技术构建太空诱变宫颈癌细胞cDNA消减文库

目的利用抑制性消减杂交技术构建太空诱变宫颈癌细胞的消减文库,为进一步从基因表达水平研究空间特殊环境影响肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定基础。方法采用SuperSMART和SSH技术,以太空诱变的宫颈癌48A9细胞株作为Tester,地面正常对照组宫颈癌细胞株作为Driver,分离太空诱变的宫颈癌48A9细胞中差异表达的基因片段;连接T载体,转化宿主菌,构建太空诱变的宫颈癌48A9细胞cDNA抑制性消减文库。结果经蓝白筛选后随机挑取300个阳性克隆,以接头1和2R内侧序列为引物进行菌液PCR扩增鉴定阳性克隆,结果显示其中288个克隆有插入片段,阳性率为96％,大小分布在0．2—1．0kb间。结论本实验利用抑制性消减杂交技术成功的构建了高质量的太空诱变宫颈癌细胞消减文库,为进一步从基因水平阐明太空特殊环境对肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定了基础。     

制备免疫避孕靶抗原的新方法

本文提出利用不育、流产患者体内的抗精子、卵透明带等抗体和正常孕妇体内的阻断抗体免疫筛选cDNA基因文库制备免疫避孕靶抗原。     

抑制性消减杂交筛选生长期毛乳头细胞差异表达基因

目的 应用抑制性消减杂交构建生长期毛囊毛乳头细胞(DPC)差异表达cDNA消减杂交文库,从中克隆鉴定出差异表达基因。方法 分别从生长期DPC及休止期DPC提取总RNA;采用SMARTcDNA合成技术合成cDNA,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR;将产物与T/A载体连接构建生长期毛囊DPC的cDNA消减文库,通过反向RNA印迹杂交验证阳性克隆,测序并登录基因库寻找同源性基因。结果 成功构建了毛囊生长期DPC消减文库,并获得35个阳性克隆,其中功能已知基因22个,功能未知基因13个。结论 抑制性消减杂交技术是一种高效的筛选差异基因的方法,并可用于小量临床标本研究,本实验所发现的生长期DPC差异表达基因对今后研究毛囊生长调控可能具有重要意义。     

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

耐药淋球菌差异DNA消减文库的构建及初步筛选

目的 克隆和研究耐药性淋球菌相关基因。方法 从耐药淋球菌株RSM292C4和淋球菌标准参考菌株WHO-A细胞中提取DNA,经RsaⅠ酶切后,应用抑制性消减杂交技术构建耐药性淋球菌差异DNA消减文库并进行初步筛选。结果 耐药淋球菌差异DNA消减文库经扩增获得约2500个白色克隆,随机挑取96个白色克隆,进行PCR扩增鉴定,发现克隆中插有100~600bp大小的片段。分别以RsaI酶切样本和参照DNA为探针,与随机挑取的96个白色菌落质粒作点杂交,有5个克隆仅能与样本DNA探针杂交,而不能与参照DNA探针杂交,表明它们为RSM292C4基因组DNA所特有,可能代表某些淋球菌新基因。对这5个克隆插入的DNA片段进行测序,经送基因库和淋球菌基因组部分测序基因库检索分析,发现5个片段均为未知新序列。结论 淋球菌耐药菌株DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆淋球菌耐药的新基因奠定了基础。