利用基因打靶技术构建血管内皮特异性Stk24/25双基因敲除小鼠

目的:构建Stk24/Stk25双基因敲除小鼠模型,并对其基因型及敲除效率进行测定。方法:使用基因打靶技术构建基因敲除小鼠,利用PCR及凝胶电泳技术对亲代及子代小鼠进行基因型鉴定;并利用ＲT-qPCＲ测定目的基因在小脑血管内皮细胞中mＲNA转录水平的表达情况。结果:通过PCR技术成功检测出小鼠子代基因型Cdh5cre+/Stk24fl/fl/Stk25fl/fl纯合子小鼠,经鉴定血管内皮基因敲除Stk24、Stk25后表达量分别下降了27%（t=2.874,P=0.0207）和30%（t=17.21,P<0.001）。结论:采用基因打靶技术成功构建了Stk24/Stk25双基因敲除小鼠。     

锌指蛋白ZBTB20生物学功能的研究进展

锌指蛋白ZBTB20是ZBTB锌指蛋白亚家族的新成员,与已知的BCL6和PLZF同源.通过基因打靶小鼠和疾病人群研究,学者们发现ZBTB20在肝脏、胰岛、神经系统和免疫系统等多个器官与系统中具有重要生理学功能,是个体发育、学习记忆、痛觉感受、糖脂代谢等正常生理过程所必需的调节分子.ZBTB20表达或功能异常可导致个体发育障碍,与智障、肿瘤和代谢性疾病等多种重大疾病的病理生理过程密切相关.作为甲胎蛋白基因的主要转录抑制因子,ZBTB20在出生后肝脏甲胎蛋白基因的表达失活中发挥了关键性作用,且与肝癌预后密切相关.人群中ZBTB20基因的缺失与多种肿瘤有关,其点突变可导致Primrose综合征.本文就ZBTB20的生物学功能研究进展作一综述.     

生物素-亲和素介导以KDR为靶点的脂质体超声造影剂体外靶向实验研究

目的 以与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237为配体研制靶向脂质体超声造影剂并进行体外性能鉴定.方法 采用"生物素一亲和素"桥接法构建靶向微泡(P-Bio-Av-Bio-Mbs),将KDR不同程度表达的细胞LOVO、HUVECs和LS174T分别与P-Bio-Av-Bio-Mbs孵育,同时另将荧光标记生物素-亲和素桥接靶向脂质体微泡(FITC- P-Bio-Av-Bio-Mbs)、荧光标记的单纯小肽微泡复合物(FITC-P-Mbs)及荧光标记的普通脂质体微泡(FITC-Mbs)分别与LOVO细胞孵育,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合的花环形成率及荧光强度;分别以10 ?g、50 ?g的小肽K237预先与LOVO细胞孵育,再将P-Bio-Av-Bio-Mbs与LOVO细胞孵育,观察细胞周围微泡分布.结果 KDR强阳性表达的LOVO细胞周围花环形成率高达90.52%,荧光强度3级,KDR阳性表达的HUVECs周围花环形成率53.46%,荧光强度2级,KDR阴性表达的LS174T细胞周围少数微泡黏附,花环形成率5.57%.荧光强度0～1级,组间花环形成率比较差异有统计学意义(P<0.05).FITC-P-Bio-Av-Bio-Mbs、FITC-P-Mbs及FITC-Mbs与LOVO细胞结合,花环形成率分别为89.62%、7.56%、0%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),荧光强度分别为3级、0～1级、0级.10?g预处理组靶细胞周围花环结构明显减少,50 ?g封闭组靶细胞周围无花环形成.结论 以KDR为靶点携小肽K237的靶向脂质体造影剂通过生物素-亲和素桥介导成功制备,在体外能与靶细胞高效特异结合.针对KDR为靶点进行肿瘤新生血管分子靶向显像可能为肿瘤早期诊断提供新的思路.     

翰霍普金斯医学院细胞工程研究所发现高效率基因打靶方法

来自约翰霍普金斯医学院细胞工程研究所、德州大学西南医学研究中心等处的研究人员针对基因打靶在人胚胎干细胞中效率极低的问题，提出了一种高达80％成功率的基因打靶方法，从而建立了阵发性睡眠性血红蛋白尿疾病基因PIG-A定点突变的干细胞克隆。细胞工程研究所的程临钊教授将这一重要的研究成果公布在《Cell Stem Cell》杂志上。文章通讯作者是细胞工程研究所的程临钊教授，第一作者是约翰霍普金斯医学院的邹冀中博士，邹博士表示，     

基因打靶技术及其在寄生虫学研究的应用

基因打靶是近年来发展起来的现代分子生物学重要的实验技术之一。其原理是通过外源性DNA与细胞内基因组DNA同源序列可发生重组这一性质，人为地定点修饰改造基因组中某些基因的结构和组成，以研究该特定基因在活性中的功能或相关疾病的致病柚是，本仅就该技术的原理和基本操作以及该技术在寄生虫学研究右的应用和进展作一介绍。     

小鼠胰腺肿瘤模型的研究进展

近年来胰腺癌的发病率呈上升趋势．其中80％～90％为起源于胰腺导管上皮的胰腺导管腺癌（Dancreaticductaladenoma．PDA）。胰腺癌起病隐匿．缺乏特异性临床表现,且容易转移．恶性程度高．导致其早期诊断困难,确诊时大多已处于晚期而无法施行根治手术。胰腺癌现有治疗方案大致包括联合化学治疗（化疗）、新辅助放射治疗、分子靶向治疗,但治疗效果不十分理想,胰腺癌的5年生存率不足4％,是目前预后最差的恶性肿瘤之一。     

利用细菌内同源重组技术构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体

目的 构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体,最终获得胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入小鼠,为胰岛β细胞功能研究提供良好的基因敲除动物模型。方法 以低拷贝质粒pBR322-2s为骨架构建取获载体（retrieving vector）,应用λ噬菌体Red重组酶介导的缺口修复（gap-repair）方法,通过细菌内的同源重组克隆长度约为12 kb的小鼠胰岛素2（Ins2）基因组DNA,同时构建1个带有内部核糖体进入位点（IRES）序列、Cre重组酶序列和正负向筛选标记基因的微型打靶载体（mini-targeting vector）,最后通过同源重组获得Ins2-Cre打靶载体。结果 以Ins2基因的第3外显子为靶点,成功构建了受内源性Ins2基因启动子严格调控的表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体。结论 成功构建了在胰岛β细胞中特 异性表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体,为获得胰岛β细胞中基因特异性敲除小鼠模型提供了关键材料。     

细胞重编程及其在再生医学中的应用前景 ——写在2012年诺贝尔生理学或医学奖颁布之际

2012年10月8日,英国发育生物学家约翰·格登爵士(John B.Gurdon)和日本生物医学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)因"发现成熟细胞可以被重编程(reprogrammed)为多能性(pluripotency)"而获奖,这次获奖是在短短五年时间内干细胞领域的第二次获奖,上一次获奖是在2007年,马丁·埃文斯因1981年成功分离出小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)而与另外两名从事"基因打靶"(gene targeting)的科学家马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯共享诺贝尔生理学或医学奖.     

牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株的构建

目的构建牙龈卟啉单胞菌毒力岛基因PG0839突变菌株,为研究PG0839基因功能提供实验基础。方法扩增1 584 bp PG0839基因片段,对聚合酶链反应（PCR）产物和pUC19载体进行BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切,连接酶切产物得到质粒pPG0839-1。将2 101 bp erm基因产物插入到pPG0839-1中PG0839基因的EcoRⅤ位点,构建质粒pPG0839-2,作为电穿孔的供体质粒。电穿孔转化于受体菌牙龈卟啉单胞菌W83菌株,红霉素抗性培养基筛选阳性克隆,命名为PG0839基因突变菌株。结果运用插入失活方法构建PG0839基因突变菌株,进而通过酶切、测序、PR和反转录PCR对PG0839基因突变菌株进行验证,证实PG0839基因突变菌株构建成功。结论本实验成功构建PG0839基因突变菌株。