嘌呤霉素抗性基因捕获载体的构建及在细胞中的功能验证

目的 构建具有嘌呤霉素抗性基因捕获载体,扩大基因捕获载体的应用范围.方法 用经改造的捕获载体(gene trapping vector)稳定转染HepG2.2.15肝癌细胞系,经嘌呤霉素筛选,制作单克隆细胞株.用PCR方法验证该载体的在细胞染色体中的整合,ELISA方法证明捕获载体捕获基因后的细胞的功能改变.结果 嘌呤霉素抗性基因捕获载体整合在HepG2.2.15肝癌细胞的染色体上,并能影响细胞HBsAg和HBeAg的分泌.结论 新构建的嘌呤霉素抗性基因捕获载体能在具有G418抗性的细胞中捕获有意义的目的 基因.     

Podocalyxin在大鼠嘌呤霉素肾病模型中的表达及其意义

目的:研究大鼠嘌呤霉素肾病(PAN)模型中podocalyxin的表达,探讨其在蛋白尿发生中的意义.方法:建立PAN模型,应用光镜、电镜观察肾脏病理改变,免疫荧光法检测podocalyxin在肾脏的表达与分布.结果:①PAN 4 d组大鼠24 h尿蛋白量较对照组升高(P＜o.01),PAN 7 d组达高峰(P＜0.001),于28 d逐渐下降至正常.②透射电镜显示PAN 4 d组大鼠足突部分融合,PAN 7 d组大鼠足突广泛融合,PAN 28 d组大鼠足突形态有所恢复.③免疫荧光显示podocalyxin在肾小球表达,PAN 4 d组podocalyxin的表达较对照组降低(P＜0.05).PAN 7 d组表达明显低于对照组(P＜0.01).PAN 28 d组podocalyxin的表达明显高于PAN 7 d组(P＜0.01),与蛋白尿产生明显相关.结论:大鼠PAN模型中,podocalyxin的表达减少可引起足突融合,并与蛋白尿产生密切相关.     

肾八味胶囊对肾病综合征模型小鼠血清IL-6的影响

目的:观察肾八味胶囊对肾病综合征(NS)模型小鼠24h尿蛋白和血清白介素6(IL-6)的影响,以探讨该方对NS的免疫治疗作用机制。方法:给小鼠一次性尾静脉注射嘌呤霉素氨基核苷(Puromycin aminonucleoside,PA)复制NS模型,40只小鼠随机分为模型组、肾八味低剂量组、肾八味高剂量组、至灵胶囊组、生理盐水组,采用BCA法检测各组小鼠24h尿蛋白,采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清IL-6的含量。结果:模型组小鼠24h尿蛋白和血清IL-6均较生理盐水组显著升高,中药灌服后能显著降低NS小鼠24h尿蛋白和血清IL-6的含量。结论:降低血清IL-6的含量可能是肾八味胶囊治疗NS的作用机制之一。     

肾上腺髓质肽在大鼠足细胞损伤模型中调控肾小球壁层上皮细胞分化

 目的  探讨肾上腺髓质肽(adrenomedullin,AM)是否通过调控肾小球壁层上皮细胞(parietal epithelial cells,PECs)分化参与对大鼠足细胞损伤模型的保护作用及可能的分子机制。方法  雄性SD大鼠经一次性腹腔注射嘌呤霉素氨基核苷(puromycinaminonucleoside,PAN) (15 mg/100 g体重)建立足细胞损伤模型,随机分为模型组和治疗组,治疗组每天经尾静脉注射AM 蛋白质(6.6 μg/100 g体重)。分别在首次注射PAN后7、14 和21 天,观察大鼠尿蛋白水平及肾组织形态改变,并经免疫组化染色、双重或三重免疫荧光染色,检测足细胞数量、肾小球AM的表达、PECs分化以及Notch3表达变化。结果  大鼠 PAN肾病模型表现为大量蛋白尿、肾小球节段性损伤、足细胞计数显著减少。AM/claudin-1双重荧光染色显示PECs中AM表达显著增强且出现于毛细血管袢内。AM治疗可改善大鼠尿蛋白及肾组织形态,减少足细胞丢失,14天时显著增加共表达PECs(claudin-1)及足细胞特异性标志蛋白(WT-1和synaptopodin)的细胞数。Ki67与claudin-1共定位表达于PECs,但未与WT-1共表达。AM显著抑制由PAN所致的Notch3表达。结论  在大鼠PAN足细胞损伤模型中,PECs中AM表达上调提示机体的一种代偿性保护机制,AM可能通过下调Notch3信号通路而促进PECs分化,参与其促进损伤后修复的作用。     

嘌呤霉素氨基核苷大鼠模型的研究进展

嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)是研究微小病变型肾病(minimal-change nephropathy syndrome,MCNS)和局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomeruloscleorosis, FSGS)的理想动物模型,但所用剂量、给药途径的不同可使诱发的肾病有所区别.     

低蛋白血症大鼠模型的建立

目的：探讨大鼠尾静脉注射阿霉素（Adriamycin，ADR）建立低蛋白血症模型的可行性。方法：SD大鼠尾静脉一次性注射阿霉素5mg／kg、7．5mg／kg及10mg／kg。观察给药后大鼠一般情况及尿量，检测尿蛋白、血清总蛋白、白蛋白、胆固醇、甘油三酯等指标，观察肾组织病理学变化，以嘌呤霉素为阳性对照。结果：阿霉素的三个剂量中，7．5mg/kg及10mg／kg组第4天开始出现尿蛋白，第15天血清总蛋白及白蛋白明显下降。两组大鼠均出现蛋白尿，血清白蛋白及总蛋白明显下降，血清胆固醇及甘油三酯升高，肾脏病理学结果符合低蛋白血症变化，但10mg／kg组大鼠死亡率高。嘌呤霉素组亦出现类似变化。结论：大鼠尾静脉注射阿霉素7．5mg／kg，15d后可建立低蛋白血症动物模型。     

嘌呤霉素肾病大鼠肾小球中nephrin、Podocin和α-actinin与蛋白尿的关系

目的动态观察肾小球足细胞及裂孔隔膜分子nephrin,podocin和α-actinin在嘌呤霉素(puromycinaminonucleoside,PAN)大鼠肾病模型肾组织中表达的时相变化,探讨这些分子间及这些分子与蛋白尿发生的关系。方法用间接免疫荧光染色及实时定量PCR方法,检测PAN注射后12h、1d、36h、2d、5d、10d、15d及20d大鼠肾小球中nephrin,podocin和α-actinin分子分布和表达。结果(1)PAN注射后1d、2d及5d时,尿蛋白量无明显改变;10d时尿蛋白量明显增加(P=0.02);20d时恢复至对照组水平。(2)对照组大鼠肾小球中nephrin和podocin沿肾小球毛细血管袢呈连续线状分布,α-actinin沿肾小球毛细血管袢呈点线状分布。PAN注射1d后,nephrin和podocin的分布即发生改变,表现为断续、非线性分布。nephrin和podocin的分布改变随着尿蛋白的增多而加重,尿蛋白恢复时也逐渐恢复。20d时,α-actinin沿肾小球毛细血管袢呈连续线性分布。(3)免疫荧光定量分析结果表明,在PAN注射后36h(P=0.04)、2d(P=0.03)及5d(P=0.04)时,肾小球中podocin的免疫荧光染色强度明显下降,于第10d降至最低(P=0.006);自15d时逐渐恢复(P=0.007),20d后podocin的免疫荧光强度恢复至对照组水平。nephrin的免疫荧光染色强度在PAN注射第5天后出现下降(P=0.002),持续下降至第10天(P=     

通脉颗粒对嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠FDP、DD、Plg及MDA的影响

目的：观察通脉颗粒对嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠纤维蛋白降解产物（FDP）、D-二聚体（DD）、纤溶酶原（Plg）及丙二醛（MDA）的影响。方法：颈静脉插管缓慢注入嘌呤霉素氨基核苷（PAN，50mg／kg）并于此后13、16、19天尾静脉追加注射PAN 5mg／kg制备大鼠肾病模型。于造模后第二天开始灌胃给药，连续30天，收集造模后第5、10、15、20、25和30天24小时尿测定尿蛋白排泄。于第31天处死全部大鼠，取血和肾组织进行相关的检查，同时监测FDP、DD、Plg以及MDA等指标。结果：通脉颗粒在减少蛋白尿，改善肾组织病理损害的同时，能够调节FDP、DD、Plg的纤溶活性及清除MDA。结论：通脉颗粒对嘌呤霉素氨基核苷大鼠肾病模型的治疗作用，可能与改善纤溶功能和促进过氧化脂质的清除有关。     

嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中podocin表达与分布的影响及其意义

目的Podocin是构成肾小球足细胞裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）完整性的重要分子，其表达异常与大量蛋白尿的形成有关。本研究采用体外培养肾小球足细胞系，探讨足细胞损伤过程中，podocin mRNA表达和分布变化与足细胞损伤的关系。方法将体外培养的足细胞采用随机数字表法设立为实验组与对照组。实验组采用嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN）刺激（剂量为50μg／mL），分别于8h，24h和48h观察细胞形态、提取总RNA和细胞免疫组化观察podocin的分布。对照组用含10％FBS的RPMI 1640培养液培养。细胞图像应用Image J图像处理软件，计算实验组与对照组在上述各时间点200倍镜下随机选择的30个细胞的相对面积，半定量RT—PCR和间接免疫荧光法检测podocin mRNA表达和分布变化。结果对照组呈星形伸出树枝状突起，相邻细胞间形成相互连接。实验组细胞体缩小，足突回缩、消失，细胞间失去相互连接。上述各时间点两组间podocin mRNA表达比较，差异无显著意义（P〉0．05）。Podocin在对照组呈细丝状均匀分布于细胞核膜、细胞质及细胞膜；在实验组主要沿细胞核膜呈点线样分布，刺激后8h和24h细胞质有少许分布，刺激48h后出现细胞膜、细胞质分布缺失。结论Podocin分布异常与足细胞损伤密切相关，损伤早期即有变化；podocin分布异常是足细胞损伤过程中的重要分子效应。     

Nehrin在微小病变型肾病大鼠模型中的表达

目的:观察nephrin在大鼠氨基核苷嘌呤霉素肾病模型(PAN)中的表达变化,探讨其在蛋白尿发生中的作用。方法:通过建立大鼠氨基核苷嘌呤霉素肾病模型,应用光镜、电镜观察肾脏病理改变,应用免疫组织化学技术和RT鄄PCR观察nephrin在不同时间点肾病模型大鼠蛋白水平和mRNA水平表达改变情况。结果:①PAN注射后第1天和第3天,大鼠24h尿蛋白的排泄量较对照组无显著差异;第10天达高峰,较对照组有显著差异(P<0.01);第20天,尿蛋白排泄量逐渐下降,较对照组仍有显著差异(P<0.05);②在PAN肾病模型第3和第10天,透射电镜显示足细胞足突融合;③nephrin蛋白和mRNA水平的表达在大鼠PAN肾病模型第1天即出现下降,第3天出现明显下降,第10天下降到最低点,第20天,随着蛋白尿的恢复nephrin的表达也逐渐恢复;④肾小球足细胞nephrin表达的变化与肾病模型大鼠24h尿蛋白定量的变化呈负相关。结论:①nephrin表达的改变与大鼠氨基核苷嘌呤霉素肾病模型蛋白尿的发生密切相关;②nephrin是判断肾小球足细胞损伤的一个早期重要指标。