兔BP-EPCs对自体BMSCs体外扩增和分化能力的影响研究

[目的]通过研究大耳白兔外周血来源的血管内皮祖细胞(BP-EPCs)对骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)体外增殖和分化能力的影响,筛选更有潜力两种细胞共培养系统从而为构建组织工程骨的基础研究和临床治疗提供更多的资料支持。[方法]通过密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化兔EPCs和BMSCs,实验分两组:PB-EPCs和BMSCs间接共培养组中BMSCs为实验组,单独BMSCs组为对照组。观察两组细胞形态。对两组第三代细胞进行成骨和成脂诱导并评估两组BMSCs分化能力。[结果]两组细胞体外培养形态规则,增殖能力强,生长曲线呈S型。其中兔EPCs和BMSCs间接共培养组较BMSCs单独培养组细胞增长速度更快,两组差异具有统计学意义(P0.05)。经成骨诱导后,间接共培养组BMSCs出现钙结节时间早且茜素红染色较深,碱性磷酸酶和骨钙素分泌量较单独BMSCs组显著增高,两组差异具有统计学意义(P0.05)。经成脂诱导后,间接共培养组油红O染色较深,两组差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]兔EPCs和BMSCs间接共培养组细胞在增殖速度和分化能力方面均优于BMSCs单独培养组,提示将BP-EPCs和BMSCs共培养系统作为种子细胞构建组织工程骨有更大的使用潜能。     

三维共培养模型下人脐静脉内皮细胞对鼻咽癌CNE2细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响

目的探讨三维共培养下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对CNE2细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响。方法采用Transwell小室对HUVEC细胞和CNE2细胞进行共培养,CCK-8法比较两组实验中CNE2细胞增殖能力,细胞计数法比较细胞迁移能力,以及Matrigel胶法比较侵袭能力。结果 HUVEC与CNE2共培养条件下,共培养组迁移能力显著高于非共培养组(P0.01)。共培养组侵袭能力显著高于非共培养组(P0.01)。在增殖实验中,共培养组和非共培养组的OD值第3天,第4天及第5天,共培养组的细胞增殖率显著高于非共培养组(P0.05)。结论在三维共培养条件下,HUVEC对CNE2鼻咽癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力有促进作用。     

S100β基因修饰的大鼠嗅鞘细胞与脱细胞异种神经桥接体共培养体系的生物学特性研究

目的:通过观察S100β基因修饰的SD乳鼠嗅鞘细胞(OECs)在脱细胞异种神经桥接体(ANX)的黏附情况及分泌功能,研究S100β修饰的OECs与ANX共培养体系的生物学特性。方法:用表达S100β的重组慢病毒感染SD乳鼠的OECs (S100β-OECs),利用流式细胞术检测细胞的感染效率;将感染成功的细胞注入通过化学萃取法制作的ANX内,通过扫描电镜及免疫荧光染色法观察各组OECs的黏附情况及分泌功能。结果:GFPOECs及S100β-OECs的感染效率分别为(73. 10±2. 69)%和(73. 50±4. 59)%;通过扫描电镜观察到ANX内原有细胞主要结构基本完全去除,仅保留了细胞的的基膜结构,GFP-OECs及S100β-OECs在ANX内沿基膜纵轴方向聚集生长;免疫荧光染色结果发现,生长在ANX上的OECs、GFP-OECs、S100β-OECs均表达NGF、BDNF等神经营养因子,且S100β-OECs组S100β蛋白表达高于其他两组(P 0. 05)。结论:S100β-OECs可稳定的过表达S100β蛋白,在S100β-OECs与ANX共培养体系中,S100β-OECs与ANX的生物相容性良好。     

甲基莲心碱对人肝星状细胞共培养条件下的人肝癌细胞中的转化生长因子(TGF-β1)的影响

目的：研究甲基莲心碱对人肝星状细胞LX-2细胞株共培养条件下的人肝癌细胞HepG2细胞株中的转化生长因子（TGF-β1）的影响。方法：Transwell建立HepG2细胞和LX-2细胞共培养系统,同时设置阴性对照组和单独的HepG2细胞培养组;倒置显微镜下观察甲基莲心碱诱导肝星状细胞共培养条件下的肝癌细胞的凋亡形态变化;酶联免疫（ELISA）检测上清液中分泌的转化生长因子（TGF-β1）的浓度;Western Blot和实时定量PCR分别从蛋白水平和mRNA水平测定TGF-β1的表达情况。结果：甲基莲心碱作用共培养条件的HepG2细胞48 h,给药组相较于对照组细胞数目减少,形态皱缩,但没有单独的HepG2细胞组凋亡形态明显;TGF-β1经ELISA、Western Blot和实时定量PCR检测,其表达水平均随着药物剂量的增大而下调,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,但没有单独的HepG2细胞组TGF-β1水平下调明显。结论：甲基莲心碱能够下调肝星状细胞LX-2细胞株共培养条件下的肝癌细胞HepG2细胞株的TGF-β1的表达来诱导细胞凋亡,并呈现出剂量依赖性,但肝星状LX-2细胞对甲基莲心碱诱导共培养下的HepG2细胞的凋亡有一定地抑制作用。     

Lanthanum chloride or citrate is absorbed mainly via M cells in gastrointestinal tracts with lanthanum phosphates as the transformed species

本工作以氯化镧(LaCl₃)和柠檬酸镧(LaCit)为代表性化合物, 对稀土在消化道内的物种存在形式及吸收转运机制进行了研究和探讨。研究采用了人工胃液和肠液模拟体内消化道环境。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测结果表明, 大于99.9%的La发生了沉淀。散射光粒度(DLS)分析结果显示, 这些微粒的平均粒径由200 nm (孵育2 h)增大到600 nm左右(孵育24 h), 这表明微粒之间发生了聚集。傅立叶变换红外光谱(FTIR)研究表明, 稀土微粒的主要成分为稀土磷酸盐。为研究稀土在肠道中的吸收转运机制, 以LaCit (2或100 mg/kg/day)对小鼠灌胃给药7天, 取小肠的普通肠段和派氏结进行了ICP-MS分析。派氏结中的La含量明显高于普通肠段, 这提示稀土微粒可能主要由派氏结上淋巴滤泡上皮中的M细胞吞噬转运。此外, 建立了Caco-2细胞单培养模型和 Caco-2/Raji B 细胞共培养模型分别模拟小肠上皮和滤泡上皮。结果显示, Caco-2/Raji B 细胞共培养模型转运的La含量显著高于Caco-2细胞单培养模型(大约60倍左右), 且 Caco-2 细胞单层透过的镧的量极低, 这说明M细胞是吸收转运磷酸镧的主要途径。以上结果表明氯化镧和柠檬酸镧在胃肠道主要以磷酸镧微粒形式通过M细胞进行转运吸收。本研究将为稀土在农业和医学中的合理应用提供科学依据。     

通心络干预心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的保护作用

目的 观察心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的影响及通心络的干预作用。 方法 制备3种心肌微血管内皮细胞条件培养液：正常内皮细胞条件培养液（N-CM）,同型半胱氨酸诱导损伤的心肌微血管内皮细胞条件培养液（H-CM）和通心络干预的心肌微血管内皮细胞条件培养液（T-CM）。将心肌细胞随机分为4组：正常对照组、N-CM组、T-CM组及H-CM组,采用相应培养液培养。倒置显微镜观察心肌细胞形态,酶联免疫吸附法检测细胞上清液心肌肌钙蛋白T（cTnT）含量,JC-1试剂盒测定细胞中线粒体膜电位（MMP）,Western blot法检测细胞色素C（Cyt C）和钙网蛋白（CRT）蛋白表达。 结果 与正常对照组比较,N-CM组细胞形态无明显变化,细胞上清液cTnT含量、MMP水平、CRT及Cyt C蛋白表达无明显变化（P>0.05）;与N-CM组比较,H-CM组细胞皱缩,细胞边缘模糊,有大量坏死细胞漂浮,细胞上清液cTnT含量、CRT及Cyt C蛋白表达升高,MMP水平降低（P<0.01）;与H-CM组比较,T-CM组细胞无明显皱缩,细胞边缘较清楚,坏死漂浮细胞减少,细胞上清液cTnT含量、CRT及Cyt C蛋白表达降低,MMP水平升高（P<0.05, P<0.01）。结论 受损心肌微血管内皮细胞的条件培养液可损伤心肌细胞,其损伤机制可能与CRT介导的线粒体功能受损有关,通心络可抑制该损伤过程。     

Transwell小室共培养条件下微血管内皮细胞对成骨细胞增殖、凋亡的影响

背景 骨微血管在骨稳态维持过程中发挥着重要作用,"血管-成骨耦联"现象已经成为目前临床医学工作者关注的焦点问题,揭示微血管内皮细胞与成骨细胞之间的相互调控关系将为骨相关疾病的临床治疗提供新的思路.目的 探究在共培养条件下,微血管内皮细胞bEnd.3对成骨细胞MC3T3-E1增殖、凋亡的影响.方法 利用Transwell小室建立MC3T3-E1/bEnd.3共培养体系,分别设置对照组(单独培养MC3T3-E1细胞)和共培养组(MC3T3-E1细胞和bEnd.3细胞共同培养).CCK-8实验检测两组MC3T3-E1细胞增殖活性的变化,PI单染流式细胞术检测两组MC3T3-E1细胞周期的变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测两组MC3T3-E1细胞凋亡率的变化,Western blotting检测两组MC3T3-E1细胞PCNA、Bax、Cleaved Caspase-3等增殖/凋亡相关蛋白的表达变化情况.结果 与单独培养的MC3T3-E1细胞相比,共培养组的MC3T3-E1细胞增殖活性显著增强(P<0.05),S期细胞比例显著增高(P<0.01),G2/M期细胞比例显著增高(P<0.05),PCNA表达升高(P<0.01),凋亡率下降(P<0.05),Bax和Cleaved Caspase-3表达降低(P<0.05).结论 在Transwell小室共培养条件下,微血管内皮细胞bEnd.3能够显著促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,并抑制其凋亡.     

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响（R68)

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为7.410±1.738、8.844±1.981、22.4272±2.058、2.445±0.2517(P0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。     

成骨细胞-软骨细胞共培养通过MAPK信号上调软骨细胞HIF-1通路的研究

  目的  研究与成骨细胞共培养对软骨细胞低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor, HIF）-1通路的影响及其机制。  方法  采用胰酶消化法从新生小鼠膝关节及颅骨处分别提取软骨细胞和成骨细胞。使用6孔板（培养软骨细胞）和Transwell小室（培养成骨细胞）构建两种细胞的共培养体系。使用qRT-PCR分析共培养24 h后软骨细胞中HIFs及其靶基因丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1）的mRNA表达变化;Western blot用于检测共培养48 h后软骨细胞中HIFs、PDK1蛋白表达以及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信号通路的改变;活性氧（reactive oxygen species, ROS）染色以显示共培养48 h后软骨细胞ROS生成变化。  结果  qRT-PCR和Western blot结果表明,软骨细胞和成骨细胞共培养后软骨细胞中HIF-1α的基因和蛋白表达水平上升（P<0.05）;HIF-1靶基因PDK1的基因和蛋白水平同样上调（P<0.05）;ROS染色显示与成骨细胞共培养使软骨细胞ROS生成减少;Western blot检测到共培养软骨细胞的细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）1/2和p38信号增强（P<0.05）。  结论  与成骨细胞共培养增强了软骨细胞ERK1/2和p38信号,上调了软骨细胞的HIF-1通路。     

成熟SVFs细胞与Hepa1⁃6细胞共培养模型的建立及对肝细胞脂代谢的影响

目的：建立小鼠成熟脂肪细胞血管基质部分（stromal vascular fraction,SVF）与小鼠肝细胞（Hepa1?6）共培养模型,研究成熟脂肪细胞对肝细胞脂质堆积以及代谢的影响。方法：从小鼠皮下脂肪分离提取原代SVF细胞,经体外分化成熟后,以Transwell小室建立成熟SVF细胞和Hepa1?6细胞间接共培养48 h体系。应用逆转录?聚合酶链反应法（RT?PCR法）检测SVF细胞PPARγ和PGC?1α等分化相关基因及Hepa1?6细胞CD36、FATP2、GPAT1等脂代谢相关基因的表达。酶法检测经共培养后的Hepa1?6细胞甘油三酯水平。结果：小鼠原代SVF细胞经诱导成熟后,出现明显较大脂滴;成熟SVF细胞中PPARγ和PGC?1α等分化标志物较未分化SVF细胞显著升高;Hepa1?6细胞甘油三酯水平明显高于未共培养组;Hepa1?6细胞GPAT1、CD36基因表达水平明显升高。结论：已成功建立成熟脂肪细胞与Hepa1?6细胞Transwell共培养模型。肝细胞与成熟脂肪细胞共培养可以诱导其脂质堆积增加,该过程可能通过上调肝细胞中CD36 和GPAT1的表达水平增加脂肪酸的吸收和甘油三酯的合成通路实现。