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1.
大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定   总被引:14,自引:3,他引:11  
目的:克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及霍乱弧菌肠毒素B亚单位(CTB)基因,构建其表达载体。方法:采用高保真PCR分别从E.coli44815株与V.cholerae东74株基因组DNA中扩增LTB与CTB基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。分别构建pET32a的LTB及CTB表达载体,在E.coliBL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE及GM1-ELISA鉴定表达产物。结果:所克隆的LTB和CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为99.12%-99.71%和98.54%-99.42%,氨基酸序列同源性分别高达97.58%-99.19%和96.77%-99.19%。pET32a-LTB-BL21DE3和pET32a-CTB-BL21DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的30%和10%左右。GM1-ELISA结果证实LTB及CTB融合蛋白均能与牛GM1结合。结论:本研究成功地构建了LTB与CTB表达系统,所表达的LTB与CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。  相似文献
2.
人CTLA-4胞外区cDNA的克隆及Ig融合蛋白表达载体的构建   总被引:10,自引:4,他引:6  
目的 克隆人CLTA-4胞外区cDNA-4胞外区与人免疫球蛋白IgG Fe融合蛋白表达载体,为研究CTLA-4/Ig融合蛋白及其临床应用奠定基础。方法 从抗人CD3单克隆抗体和PMA活化的健康人中国外周血淋巴细胞总RNA中,扩增人CTLA-4基因胞外区cDNA片段,经HindⅢ+BclⅠ双酶切后定向插入Ig融合蛋白表达载体。结果 从活化人T细胞中扩增出人CTLA-4胞外区cDNA片段,并将其正确插  相似文献
3.
鲑鱼降钙素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引:9,自引:0,他引:9  
用PCR方法从鲑精DNA中分离出编码蛙鱼降钙素(sCT)基因,并将其插入带有谷脱甘肽转移酶(GST)基因的融合表达载体pGEX-2T上,转入大肠杆菌JM109中,IPTG诱导表达。融合蛋白(GST-sCT)表达量占菌体总蛋白量的38%~40%。用亲和层析方法纯化该融合蛋白,达80%电泳纯,降钙素酶联免疫试验呈阳性反应。这为生产重组sCT进而研究它的功能和应用打下了基础。  相似文献
4.
截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用   总被引:9,自引:2,他引:7  
目的:观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用.方法:通过反转录PCR方法获取人全长bid基因,再经PCR方法克隆得到截短型bid(truncated bid,tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体,脂质体法转染HeLa细胞,通过间接免疫荧光,电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况.结果:成功获得人bid基因,构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素(PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体(pcDNA3-tbid61,pcDNA3-PE-tbid61).与对照组相比,在转染后12~48h内两种基因的表达均导致.HeLa细胞发生凋亡,且两活性相当,结论:截短型Bid及其融合蛋白可促进转染的HeLa细胞发生凋亡.  相似文献
5.
目的 为协同人白细胞介素(IL-2)与乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)前S抗原的生物学功能,探索治疗慢性乙肝的特异性免疫药物。方法用聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术构建了HBV完整前S抗原和IL-2的嵌合基因,并在大肠杆菌中高效表达了IL-2-前S抗原融合蛋白。结果该融合蛋白保留了IL-2和前S抗原天然分子的生物学活性,能维持白细胞介素2依赖株细胞增殖,其比活性约10~7U/mg蛋白。该融合蛋白能与前S1和前S2单克隆抗体结合及与多聚人血清白蛋白(PHSA)结合,说明其具有相应抗原表位及受体。其诱导Balb/c小鼠产生抗前S抗体的效价分别是单独的前5抗原、前S抗原与IL-2的混合物及MS-2-前S融合分子的13、9和11倍多。结论IL-2.前S抗原融合蛋白能增强前S抗原的免疫原性,促进机体的免疫应答;另外,IL-2-前S抗原融合蛋白在人体内具有双重导向作用,可能成为新一代慢性乙肝和肝癌的免疫治疗剂。  相似文献
6.
Mfn2基因对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的促进作用及其机制   总被引:9,自引:0,他引:9  
目的研究线粒体融合蛋白基因(mitofusion-2,Mfn2)促进大鼠血管平滑肌细胞(rVSMCs)凋亡的作用及其机制。方法以空载缺陷型腺病毒(Adv-GFP)为对照,以复制缺陷型腺病毒作为载体,将Mfn2转移到rVSMCs中,Western blot法观察感染后Mfn2基因的表达;TUNEL法检测凋亡细胞阳性率;琼脂糖凝胶电泳观察过表达Mfn2基因对细胞凋亡的影响;Western blot等检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-9的含量。结果高表达Mfn2基因促进rVSMCs凋亡,使rVSMCs线粒体Bcl-2蛋白表达减少、Bax增多,胞质Caspases-9被激活。结论Mfn2基因促进rVSMCs的凋亡,其机制与活化线粒体凋亡途径有关。  相似文献
7.
幽门螺杆菌临床菌株hpaA基因的克隆和表达及鉴定   总被引:8,自引:3,他引:5  
目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)hpaA基因,构建hpaA基因表达载体,鉴定其表达的融合蛋白免疫性。方法:采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增hpaA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的hpaA表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果:所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为94.25%-97.32%,氨基酸序列同源性高达95.38%-98.46%。pET32a-hpaA-BL21DE3系统的HpaA融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的40%左右。HpaA融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗体。结论:本研究成功地构建了Hp hpaA高效表达系统,所表达的HpaA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的抗原。  相似文献
8.
目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3'末端加“A”并纯化.然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶(Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1.CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U/g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。  相似文献
9.
目的:构建小鼠肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)和绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因真核表达质粒,然后在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达,为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法:从小鼠肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段,将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定,然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游,构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1,将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h,用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果:扩增出了长约1360bp的基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定无误;将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体,酶切鉴定无误;重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后,免疫组化染色可见细胞有阳性棕染,同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒;重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白,为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。  相似文献
10.
TAT PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对白血病细胞系K562凋亡诱导作用   总被引:7,自引:2,他引:5  
目的研究基因重组HIV-1反式激活蛋白(TAT)的蛋白转导域(PTD)与BCR/ABL SH3结构域融合蛋白(PTD-BCR/ABL SH3)导入白血病细胞株(K562)的细胞后对K562细胞增殖、凋亡的影响. 方法通过台盼蓝拒染法、流式细胞术、透射电镜(TEM)、激光共聚焦显微镜(CLSM)及凋亡细胞原位标记(TUNEL)等方法,测定了PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白作用于K562细胞后细胞的增殖、形态学变化、细胞凋亡和细胞周期参数的改变. 结果≥5 μmol*L-1的PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对K562细胞生长有抑制作用,浓度越高,抑制作用越强;苔盼蓝拒染法、细胞形态学、电镜超微结构、TUNEL原位杂交和FCM检测的观察证明,PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白可引起K562细胞的凋亡和坏死;FCM检测显示该融合蛋白可将细胞阻滞在G2/M期. 结论 PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白进入K562细胞后可引起细胞凋亡和坏死,导致细胞增殖抑制. 这一结果可能为慢性粒细胞性白血病(CML)的治疗提供一种新的治疗策略.  相似文献
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