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1.
目的 克隆血小板衍生生长因子A链(platelet-derived growth factor A chain,PDGF-A)基因,以逆转录病毒载体pLXSN为骨架携带PDGF-A基因转染猪骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs),为应用PDGF-A基因修饰bMSCs进行创面修复奠定基础.方法 采用RT-PCR二步分离法,以人肝癌细胞总RNA为模板,扩增PDGF-A基因的全长cDNA编码序列,构建PDGF-A基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并将其导入病毒包装细胞PA317中,经G418筛选并扩增,以病毒液感染NIH3T3细胞,选出抗性克隆,测其病毒滴度,将高滴度病毒液感染bMSCs.采用RT-PCR、Southern blot和ELISA法,分别检测PDGF-A基因转染bMSCs的效率及PDGF-A在bMSCs中的表达水平;光镜、MTT法、成骨与成脂诱导分别检测bMSCs转染PDGF-A基因后的生长状态、增殖情况及干细胞特性.结果 经测序验证,克隆到PDGF-A基因的全长cDNA序列与GenBank所报告的该基因序列完全一致.成功构建了PDGF-A链基因的逆转录病毒载体pLXSN/PDGF-A,并实现了PDGF-A基因在bMSCs的稳定表达.bMSCs转染PDGF-A后的生长状态、增殖情况良好,且仍具干细胞特性.结论 成功地将PDGF-A基因克隆到pLXSN载体中,并实现了PDGF-A基因在bMSCs中的稳定表达.bMSCs转染PDGF-A后仍具于细胞特性.  相似文献
2.
人干细胞因子在大肠杆菌中的表达研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 经过改造重组人干细胞因子(human stem cell factor,hSCF),提高其表达量。方法 应用人工合成寡核苷酸引物及PCR技术,改变人工干细胞因子hSCF cDNA起始密码子ATG与SD序列之间的距离及在翻译起始区(即N端氨基酸)部分采用大肠杆菌(E.coli)喜用型密码子的策略,使重组表达质粒pBV220-hSCF在E.coli中获得高效稳定表达。结果 DNA序列测量证明基因  相似文献
3.
目的 构建携带促血管生成素(Angiopoietin)基因并稳定表达的肝癌细胞系SMMC7721,为进一步研究奠定基础。方法 选择本身不表达Angiopoietin的肝癌细胞系SMMC7721,通过脂质体介导的基因转染方法将Angiopoietin基因导入SMMC7721肝癌细胞系,并用G418筛选稳定表达的细胞克隆,构建携带Angiopoietin基因并稳定表达的SMMC7721肝癌细胞系。用RT-PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白水平均检测新构建的肝癌细胞系是否携带了Angiopoietin基因并能稳定表达其蛋白产物。结果 成功构建了携带Angiopoietin基因的肝癌细胞系,新的细胞系可以稳定表达外源基因及其蛋白产物。结论 脂质体介导基因转染法是一种高效转染方法,新细胞系的建立将为进一步的促血管生成素在肝癌血管的生成和转移中的作用研究奠定基础。  相似文献
4.
目的:研究大剂量(2Gy)和低剂量(0.075Gy)X射线诱导pEgr P16重组质粒稳定转染的食管癌细胞株EC9706凋亡的作用。方法:将脂质体包裹的pEgr P16重组质粒,转染食管癌细胞系EC9706中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞;采用Westernblot方法检测不同剂量X射线诱导后P16的表达;观察不同剂量X射线照射后,EC9706细胞凋亡率的变化。结果:pEgr P16重组质粒转染EC9706细胞,并获得稳定转染的细胞;2Gy和0.075GyX射线照射均可诱导P16表达增强;稳定转染的细胞经2Gy和0.075GyX射线照射,细胞凋亡率明显高于假照射(0Gy)组(P<0.05~0.01)。结论:0.075GyX射线照射可诱导稳定转染的EC9706细胞中P16表达增强,使诱导细胞凋亡率提高。  相似文献
5.
生长抑制因子诱导膀胱肿瘤细胞凋亡的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
Li L  He DL  He H  Wang XY  Zhang LL  Luo Y  Nan XY 《Zhonghua yi xue za zhi》2005,85(25):1766-1769
目的探讨生长抑制因子(PML)诱导膀胱肿瘤细胞凋亡的分子机制。方法应用脂质体Lipofectamine2000分别将重组可诱导表达的真核表达载体PMEP4/PML和对照PMEP4空载体转染到膀胱肿瘤细胞系UM-UC-2中,300μg/ml潮霉素B筛选稳定表达PML的抗性克隆。激光共聚焦检测PML蛋白表达。DNAladder法检测肿瘤细胞凋亡。Western印迹法检测凋亡相关蛋白表达情况。结果经5μmol/L的CdSO4诱导表达后,激光共聚焦显微镜观察发现转染PMEP4/PML组的细胞核内有散在的斑点样的黄绿色荧光亮点,而转染空载体PMEP4组细胞未见特异性的荧光斑点表达。DNA梯度法显示转染PML细胞在诱导PML表达后24h出现梯状凋亡条带。Western印迹法检测凋亡相关蛋白半胱氨蛋白水解酶3、活化PARP上调,而survivin的表达水平下调。结论PML诱导膀胱肿瘤细胞凋亡可能与上调半胱氨蛋白水解酶3、活化PARP蛋白,抑制survivin的表达有关。  相似文献
6.
应用逆转录病毒载体构建荧光标记的K562细胞模型   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的:采用逆转录病毒载体系统构建荧光标记的K562细胞模型.方法:将增强绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA插入载体pCMV-hyg,构建重组质粒pCMV-EGFP-hyg,并与逆转录病毒载体质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞生产重组逆转录病毒,感染K562细胞;通过Hyg筛选建立EGFP自身标记的K562细胞模型.应用流式细胞仪及荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达.比较EGFP-K562细胞与K562细胞生长曲线.通过外周血淋巴细胞的NK活性试验观察EGFP-K562能否用于有关实验研究.结果:应用EGFP cDNA成功构建pCMV-EGFP-hyg,与逆转录病毒载体系统质粒共转染293T细胞后产生含EGFP的重组逆转录病毒,48 h收集的病毒滴度达1.5×106 CFU/ml.重组逆转录病毒感染K562细胞后,经Hyg筛选,98%以上稳定表达EGFP.长期培养20代,EGFP表达稳定,对K562细胞生长无影响.以EGFP-K562为靶细胞的NK活性试验显示40:1效靶比,孵育4 h最敏感.结论:应用逆转录病毒载体系统成功构建稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-K562细胞模型,NK活性试验提示EGFP-K562可用作实验研究的新型靶细胞模型.  相似文献
7.
目的构建hIL-17F重组逆转录病毒载体并研究它在293T细胞中的表达。方法以测序验证的pUCm-T/hIL-17F为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因片段(包括20aa信号肽序列,而且hIL-17F基因内EcoR I酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变,即AA T→AA C,均为Asn),并正向插入逆转录病毒载体pSIV-1后经PCR、双酶切和测序鉴定。将构建正确的pSIV-1/hIL-17F与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后,采用脂质体法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟重组逆转录病毒感染293T细胞,经G418筛选获得阳性细胞株,并应用PCR、RT-PCR和dot-ELISA法检测hIL-17F目的基因在293T细胞中的整合、转录和表达。结果成功构建了hIL-17F基因内EcoRI酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变的重组逆转录病毒载体pSIV-1/hIL-17F,并在293T细胞中稳定表达。结论以逆转录病毒为载体感染的稳定表达rhIL-17F的293T转基因细胞株的首次获得,为进一步研究hIL-17F的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。  相似文献
8.
F10基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 检测葡萄胎发病新基因F10在人多种细胞系中转录水平的表达,从中选取F10低表达的细胞株,构建F10稳定转染的表达系统,研究F10的功能.方法 荧光定量PCR检测F10在人A549、16HBE、Bel7402、HIC、HepG2、293、PC、MGC细胞株中的表达差异.采用电穿孔介导基因转染技术将已构建的pRc-CMV2-F10、pRc-CMV2转染A549细胞系.经G418筛选获得阳性单克隆细胞.细胞扩大培养后,荧光定量PCR技术鉴定F10基因在阳性克隆细胞中的表达.结果 新基因F10在人的8种细胞系中呈不同程度的表达,其中在Bel7402、PC、MGC中呈高表达,在HepG2、HIC中表达次之,293中表达量较低,16HBE、A549中表达量最低;稳定转染细胞株A549具有F10基因的整合和相应mRNA的高表达.结论 成功构建了稳定表达外源新基因F10的肺癌细胞系,为进一步研究F10基因的生物学功能提供了实验材料.  相似文献
9.
目的:构建含有LacZ标记基因的真核表达载体和稳定表达LacZ的转基因细胞,并建立简易有效的检测方法。方法:采用脂质体转染法将装有LacZ基因的真核表达载体pcDNA3导入鼠成纤维细胞L929,G418筛选LacZ基因稳定表达细胞株,并应用超声波破碎和贴壁细胞悬浮培养的方法来检测转基因细胞的转染率及目的蛋白的表宕。结果:成功构建了稳定表达LacZ基因的转基因细胞,超声波破碎后其上清与β-半乳糖苷酶(LacZ)的底物X-gal反应显兰色;辅有固体琼脂粉的平皿中细胞培养至第4天开始显兰色,并随时间的延长,比率增加,最终可高达100%。结论:LacZ基因在哺乳动物细胞中可稳定表达,建立的检测方法具有简单及重复性好的特点。  相似文献
10.
目的:建立稳定表达BMPⅡ型突变受体的Tca 8113细胞,以便进一步从信号转导水平探讨、认识BMPs对口腔上皮恶变的作用机理;方法:用FuGENE6 Transfection Reagent Kit真核转染试剂盒将携带BMPsⅡ型突变受体cDNA的真核表达载体转染Tca 8113细胞;结果:得到抗G-418的阳性细胞克隆转染细胞,neo基因原位杂交阳性;结论:建立了稳定表达骨形成蛋白(BMPs)Ⅱ型突变受体的Tca 811细胞珠。  相似文献
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