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1.
不同引物及数据分析方法对定量PCR结果的影响   总被引:4,自引:1,他引:3  
目的:研究不同引物及数据分析方法对实时荧光定量PCR SYBR Green染料法检测基因表达差异结果分析的影响.方法:通过Primer Express 2.0软件对目的基因CCNDI、C-JUN分别设计4对不同引物进行SYBR Green染料法定量PCR扩增.并分别使用2-△△CT法、Pfaffl法及相对标准曲线法计算肺癌紫杉醇敏感细胞株及耐药细胞株问日的基因的表达差异.分析不同引物和数据计算方法对实验结果的影响.结果:统计学分析表明,引物的扩增效率对定量PCR结果分析有显著影响.不同引物特异性扩增得到的样本间表达倍数有显著差异(P<0.05).3种计算方法中,Pfaffl法与相对标准曲线法无统计学差异(P>0.05),而2-△△CT法与其他2种方法均有显著差异(P<0.05).结论:引物的选择对于定量PCR结果有显著影响;Pfaffl法是更准确,更合理的相对定量计算方法.  相似文献
2.
荧光实时定量PCR的研究进展   总被引:3,自引:0,他引:3  
生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容。  相似文献
3.
丙型肝炎病毒6a型感染的状态与分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:初步探讨丙型肝炎病毒6a型感染的状态.方法:对经HCV 5'非编码区(5'NCR)复合酶切分型结果为6a的3例样本(95,126,150)进行5'NCR和NS5B区的扩增、测序,然后将5'NCR和NS5B区序列与24个HCV全基因参考序列(均来自GenBank)比对并构建遗传进化树.结果:对3例分型结果为6a型的样品进行5'NCR序列分析发现,这3例样品都具有6a型特征性的第-145位的CA碱基插入,且与6a型参考序列Y12083的同源性最高,分别为0.993,0.987,0.993;进化树分析表明,3例样本都属于6a型.然而NS5B区的序列分析结果表明,95,126,150在NS5B区与1b型参考序列HC-J4的同源性最高,分别为0.934,0.930,0.926;进化树分析结果也显示它们都属于1b型,两个区的分型结果完全不同.为排除引物扩增效率的问题,使用6a型特异的引物对3例样品进行NS5B区扩增,3例样本扩增结果均为阴性.结论:我们发现的HCV 6a型的感染中,存在3例样品5'NCR和NS5B区的分型结果不一致,尚无直接证据证明其是否发生了基因重组.但是,我们的结果提示,在两个或两个以上区域进行HCV分型是非常重要的,且HCV基因型之间的重组必须纳入到HCV分型的考虑中来.  相似文献
4.
目的:探讨优化细胞裂解条件,提高植入前诊断中聚合酶链反应的扩增效率。方法:吸取单个淋巴细胞或人胚胎单卵裂球,用碱裂解液、蛋白酶K裂解液和改良的蛋白酶K裂解液进行处理,随后以巢式-聚合酶链反应扩增人肾上腺脑白质营养不良基因(ALD基因)的3号外显子,比较其扩增效率。结果:三种裂解液组对人淋巴细胞的扩增效率分别为90%,74%,87%,对人单卵裂球的扩增效率分别为98%,77%,96%。结论:在植入前诊断中,采用碱裂解液及改良的蛋白酶K裂解液优于蛋白酶K裂解液。  相似文献
5.
目的评价脂血标本的核酸定量检测实时扩增曲线,以探讨此类标本进行HBVDNA定量检测的可接受性。方法建立扩增曲线观察法、扩增效率Grubbs离散值分析法及扩增效率置信区间估计法,评价接收脂血标本进行荧光定量PCR法HBVDNA定量检测的有效性。结果该2批次扩增的各样品扩增效率数值未发现离散值,3例脂血标本的扩增效率在同批样品扩增效率的90%置信区间内,与扩增曲线观察法结果一致。结论3种评价方法均对修正标准操作程序以接收该类标本提供了支持性的依据。  相似文献
6.
目的:采用载体构建及荧光定量PCR的方法比较BCL2等位基因不同部位PCR引物在定量分析中的扩增效率,判断其用于不同等位基因转录活性分析的可靠性。方法:用PCR扩增包含定量PCR目的片段的序列,然后将扩增产物分别插入pGEM-TEasy载体中,构建TA3重组载体,再以TA3载体为模板,采用荧光定量PCR方法比较引物对之间扩增效率。结果:定量PCR结果显示引物对之间扩增效率无明显差异。结论:所检测的PCR引物对之间的扩增效率一致,可用于比较分析mbr /mbr-Nalm-6杂合子细胞系中两个等位基因表达活性。  相似文献
7.
目的: 对影响单细胞二重巢式PCR扩增的因素进行初步探讨.方法:针对β-珠蛋白基因CD41-42、IVS-Ⅱ654突变位点区域采用二重巢式PCR,分别以不同的引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液、PCR反应前采用或不采用98 ℃预变性扩增单个淋巴细胞和/或单卵裂球,了解这些因素对PCR扩增效率的影响.结果: 不同的引物浓度组中,终浓度为0.25 μmol/L R1 F1引物对与 0.3 μmol/L R2 F2引物对配对扩增效率最高;不同的Taq DNA聚合酶中TaKaRa EX Taq的扩增效率最高;中和缓冲液-1(200 mmol/L Tricine)的扩增效率显著高于中和缓冲液-2(900 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3/300 mmol/L KCl/200 mmol/L HCl)的扩增效率(P<0.05);单细胞PCR反应前采用98 ℃预变性与不采用98 ℃预变性的扩增效率间差异无统计学意义.结论:不同引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液对单细胞的二重巢式PCR的扩增效率存在明显差异,而PCR反应前采用98 ℃预变性不能提高PCR扩增效率.  相似文献
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