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1.
实时荧光定量PCR标准品的制备及应用   总被引:18,自引:3,他引:15  
罗勇军  刘昕 《重庆医学》2005,34(3):414-415
目的探讨并建立快速而准确用于实时荧光定量PCR标准品的方法.方法通过培养细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA后做PCR,电泳,胶回收,T-A克隆,测序后,大量提取质粒,送公司定量.结果获得了预期希望的质粒.结论该方法能大量制备质粒标准品,在实验中取得较满意的效果.  相似文献
2.
实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BK病毒感染   总被引:6,自引:2,他引:4       下载免费PDF全文
目的:建立肾移植术后患者尿液和外周血BK病毒(BKV)感染负荷的实时荧光定量PCR检测方法,并初步探讨其临床应用价值.方法:构建含有BKV VP1蛋白保守区核苷酸序列片段的质粒作为外参照品,采用TaqMan荧光探针检测技术,建立定量检测BKV DNA方法;并对112例肾移植术后患者,40例正常体检者的尿液和外周血标本BKV含量进行检测.结果:本研究建立的BKV实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异度及重复性较好,定量PCR方法最低检测下限为8×102copy/ml,测量批内差异为0.54%~3.78%,批间差异为0.62%~4.58%.112例肾移植术后患者尿液和外周血BKV DNA的检测阳性率分别为27.7%和11.6%,BKV DNA阳性者尿液和外周血BKV中位数水平分别为8.2×104copy/ml和2.4×103copy/ml.40例正常人BKV尿液和外周血阳性率为2.5%和0%;与正常体检者相比,肾移植术后患者尿液及外周血BKVDNA阳性率及水平明显升高(P<0.01).尿液BKV阳性率较外周血明显升高(P=0.02),但尿液和外周血中BKV含量无明显相关性.结论:实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BKV感染方法简便、可靠、准确,为进一步研究BKV感染与肾移植术后移植物丢失的关系奠定了基础.  相似文献
3.
实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中CDK4基因的表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
目的:应用实时荧光定量PCR法检测原发性肝细胞癌中CDK4基因的表达。方法:提取手术切除人肝癌和癌旁组织总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织及癌旁组织中cDK4的表达水平。结果:20例肝细胞癌标本中有18例肿瘤组织中CDK4基因表达明显高于癌旁肝组织,其中7例高出4倍以上。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量测定基因的表达;CDK4基因在肝细胞癌的发生、发展中可能起重要作用。  相似文献
4.
三种检测方法对结核病诊断价值的比较研究   总被引:5,自引:0,他引:5  
目的:比较涂片法、实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法、血清学方法检测血清结核抗体,对结核病临床诊断的应用价值。方法:用涂片法和FQ-PCR法对1714份呼吸道和体液标本同步检测,同时检测1714份血清标本的结核抗体。结果:1714份送检标本中,总阳性率涂片法为16.3%,FQ-PCR法为31.6%,血清结核抗体为43.3%;三种方法的灵敏度、特异度分别为:涂片法34.4%和100%,FQ-PCR法66.4%和100%,血清结核抗体80.7%和90.5%。结论:FQ-PCR法对结核病尤其是肺外结核的诊断具有较高应用价值;血清学方法检测血清结核抗体可作为菌阴、儿童、无痰患者及肺外结核诊断的一项重要参考指标;涂片法直观、简便、价廉,仍将是结核病实验诊断的重要手段。  相似文献
5.
大鼠心肌梗死后心肌高迁移率族蛋白HMGB1的时程变化   总被引:5,自引:0,他引:5  
目的 探讨大鼠心肌梗死模型后不同时间高迁移率族蛋白(HMGB1)的时程变化.方法 结扎SD大鼠左冠状动脉前降支造成左室大面积心梗,分别于术后1、2、4、8周测心功能判断造模是否成功后开胸取心脏.分别运用实时荧光定量PCR和Western蛋白印迹技术观察心肌梗死后不同时间点HMGB1在mRNA和蛋白水平的表达变化.结果 心功能检测提示造模成功,心梗大鼠术后早期(1 w)HMGB1 mRNA表达上调(P<0.01),而心梗后期(8周)则表达显著减少(P<0.01).与mRNA水平变化类似,HMGB1蛋白水平在心肌梗死组大鼠术后早期(1~2周)表达水平增加(P<0.01),而心梗后期(8周)则显著下调(P<0.05).结论 HMGB1作为炎症调节因子,在心梗早期对心肌的炎性反应进行调控;并在心梗后期参与调节基因转录,进行心肌修复.在心梗的不同阶段对HMGB1的表达进行干预有望减少心梗并发症,改善预后.提高患者长期存活率.  相似文献
6.
基质金属蛋白酶及其抑制物与子宫内膜异位症关系的研究   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的研究基质金属蛋白酶-2、3(MMP-2,3)、金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)蛋白及其mRNA在正常子宫内膜、子宫内膜异位症(EMS)妇女正位及异位内膜的表达。方法采用免疫组织化学法半定量分析MMP-2、MMP-3、TIMP-2在正常子宫内膜、EMS妇女正位内膜及异位内膜的表达,使用实时荧光PCR法进行MMP-2、MMP-3、TIMP-2的mRNA的定量分析。结果MMP-2、MMP-3在EMS妇女异位内膜组阳性表达高于正常对照(P〈0.05),TIMP-2在EMS妇女异位内膜组织阳性表达低于正常对照(P〈0.05),而且MMP-2、MMP-3在异位内膜标本阳性染色范围有向间质浸润的趋势。在不同的组织学周期,MMP-2、MMP-3、TIMP-2的表达情况相似,差异不具有统计学意义。EMS妇女异位内膜的MMP-2、MMP-3、TIMP-2mRNA含量均高于正常对照(P〈0.05)。在不同的组织学周期,正常妇女子宫内膜组的MMP-2mRNA含量、EMS妇女正位内膜组的MMP-3mRNA含量的差异有统计学意义(P〈0.05)。结论EMS妇女的异位内膜具有更高的侵袭性可能与异位内膜MMP-2、MMP-3的过高表达及TIMP-2的低表达有关。  相似文献
7.
不同引物及数据分析方法对定量PCR结果的影响   总被引:4,自引:1,他引:3  
目的:研究不同引物及数据分析方法对实时荧光定量PCR SYBR Green染料法检测基因表达差异结果分析的影响.方法:通过Primer Express 2.0软件对目的基因CCNDI、C-JUN分别设计4对不同引物进行SYBR Green染料法定量PCR扩增.并分别使用2-△△CT法、Pfaffl法及相对标准曲线法计算肺癌紫杉醇敏感细胞株及耐药细胞株问日的基因的表达差异.分析不同引物和数据计算方法对实验结果的影响.结果:统计学分析表明,引物的扩增效率对定量PCR结果分析有显著影响.不同引物特异性扩增得到的样本间表达倍数有显著差异(P<0.05).3种计算方法中,Pfaffl法与相对标准曲线法无统计学差异(P>0.05),而2-△△CT法与其他2种方法均有显著差异(P<0.05).结论:引物的选择对于定量PCR结果有显著影响;Pfaffl法是更准确,更合理的相对定量计算方法.  相似文献
8.
PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法.方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100 NP40、Chelex-100 TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度.结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100 NP40 法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度.结论:Chelex-100 NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR.  相似文献
9.
紫草素对肝癌细胞增殖的影响   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的研究紫草素对肝癌细胞株HepG2增殖和表达增殖诱导配体(A proliferation-inducing ligand,APRIL)水平的影响,并与化疗药顺铂进行对比。方法MTT法检测紫草素对HepG2细胞增殖的抑制作用,采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法证实肝癌细胞株HepG2上APRIL的表达,实时荧光定量PCR法检测加入不同终浓度的紫草素和顺铂后24h、48h和72h HepG2细胞表达APRIL mRNA的水平。结果紫草素对HepG2细胞有明显的增殖抑制作用,呈时间和剂量依赖性,HepG2细胞上有APRIL的表达,加入不同浓度的紫草素和顺铂后,HepG2细胞A-PRIL mRNA的水平均逐渐升高,至72h表达最高并与空白对照相比均有显著差异(P〈0.05)。结论紫草素可抑制肝癌细胞的增殖,但与顺铂一样,残存癌细胞有因APRIL表达升高而增殖能力增强的潜在趋势。  相似文献
10.
乙型肝炎病毒感染者HBV DNA与血清病毒标志物的关系   总被引:3,自引:0,他引:3  
目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)感染者HBVDNA检出情况及其与血清病毒标志物的关系。方法 采用实时荧光定量PCR(FQ PCR)检测 2 0 0份HBV感染者血清中HBVDNA含量 ,同时用全自动免疫分析仪检测HBV 5项血清标志物。结果  2 0 0份血清中 ,乙型肝炎病毒标志物不同组合组的HBVDNA阳性率有差异 ,HBsAg、HBeAg和 (或 )HBcAb阳性组阳性率约为 98.1% ,其中 96 %以上HBVDNA≥ 10 4copy/ml;HBsAg、HBcAb和 (或 )HBeAb阳性组HBVDNA阳性率约为 76 .5 % ,但其中 90 %以上HBVDNA≤ 10 4copy/ml;单纯HBV抗体阳性组HBVDNA阳性率约为13.0 % ,但均为HBVDNA≤ 10 3 copy/ml。三组间HBVDNA阳性率及分布均有明显差异 (P <0 .0 5 )。而且HBVDNA含量与疾病严重程度相关。结论 FQ PCR检测HBVDNA含量结合血清病毒标志物的检测结果对乙型肝炎的临床诊断与病情判断有重要意义  相似文献
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