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1.
B7-H1是一种重要的负性共刺激分子,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,而微小RNA具有直接的转录后调控作用。本文研究miR-570对B7-H1表达的调控作用。首先将miR-570及其抑制剂anti-miR-570分别转染B7-H1表达阳性的人胃癌细胞SGC-7901和B7-H1表达阴性的人乳腺癌细胞MDA-MB-435,以流式细胞术检测B7-H1分子表达情况;然后构建pcDNA/B7-H1表达质粒与miR-570共转染CHO细胞,以流式细胞术检测CHO细胞上B7-H1分子的表达情况;最后分别构建含B7-H1基因3-UTR片段和含miR-570作用靶点序列的荧光素酶表达载体与miR-570共转染CHO细胞,用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。结果显示miR-570能显著抑制SGC-7901细胞和B7-H1基因转染细胞膜上B7-H1蛋白的表达,并能显著抑制荧光素酶表达载体表达的荧光素酶蛋白,而且anti-miR-570能上调MDA-MB-435细胞上B7-H1表达。本研究证明miR-570能显著抑制B7-H1蛋白表达,为通过抑制B7-H1信号通路以增强机体抗肿瘤免疫力的治疗途径奠定了基础。  相似文献   
2.
目的:构建表达人PD-1Δex3(ΔPD-1)基因的真核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法:通过RT-PCR的方法获得人PD-1全长(PD-1)基因,设计特异性引物,PCR方法获得PD-1Δex3基因的2个cDNA片段,通过重组PCR的方法获得ΔPD-1基因,将目的片段双酶切后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-1和pIRES2-EGFP/ΔPD-1并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入293T细胞;流式细胞术(FCM)检测转染细胞膜表面PD-1的表达;Western blot法检测培养上清中可溶性PD-1(sPD-1)的表达;间接免疫荧光实验分析ΔPD-1蛋白与PD-1两个配体PD-L1和PD-L2的结合。结果:酶切和测序结果均证实插入的基因序列正确,成功构建两个真核表达载体;FCM分析和Western blot检测结果表明,PD-1转染细胞膜表面高表达PD-1蛋白,细胞培养上清中无sPD-1蛋白,而ΔPD-1转染细胞膜表面不表达PD-1蛋白,细胞培养上清中则有大量sPD-1;间接免疫荧光实验结果表明,ΔPD-1蛋白能够与PD-1两种配体产生特异性结合。结论:成功进行PD-1Δex3基因的真核表达,证实PD-1Δex3基因编码sPD-1蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究PD-1Δex3在PD-1/PD-L信号通路中的生物学作用提供了有价值的物质基础。  相似文献   
3.
目的:建立定量检测人的可溶性B7-H3(sB7-H3)酶联检测试剂盒,并分析肝病患者外周血中sB7-H3水平及其临床意义。方法:在已获得2株识别位点不同的小鼠抗人B7-H3单克隆抗体(4H7和2E6)基础上,采用单抗4H7为包被抗体,以经生物素标记的抗体2E6为检测抗体,以重组人可溶性B7-H3为标准品,建立可溶性B7-H3分子的酶标检测方法。在此基础上对健康献血者和不同肝病患者的血清样本进行了检测并分析其临床意义。结果:研制了sB7-H3酶联检测试剂盒,检测的线性范围是8.192~2 000 ng/L,批内、批间变异系数分别为3.35%和6.97%。酶标检测板在4℃放置1个月,变异系数(CV%)<±8.6,回收率为94%~117%,特异性试验显示无交叉反应,提示该检测试剂盒具有良好的灵敏度、稳定性和特异性。用该试剂盒分析不同肝病患者外周血sB7-H3水平后发现,(1)乙肝患者以及乙肝合并肝硬化或肝癌患者与健康对照组之间并不存在差异(P>0.05);(2)重症肝炎患者血清B7-H3水平低于健康对照组(P=0.0183);(3)血吸虫性肝硬化患者血清B7-H3水平显著高于健康对照组(P<0.01)。结论:建立了灵敏、特异的人sB7-H3酶联检测试剂盒,对肝病患者检测的结果表明,不同的肝病患者外周血sB7-H3表达水平不同,显示该试剂盒具有潜在的应用价值。  相似文献   
4.
为了研制特异性识别人PD-L2(B7-DC,CD273)的鼠单克隆抗体,并对其生物学特性和PD-L2分子的表达特性进行初步分析。以高表达人PD-L2分子的基因转染细胞L929/PD-L2作为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L2作为抗体筛选细胞,L929/mock为对照细胞,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人PD-L2单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Western blot、Ig亚型快速定性试纸法、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验对单抗进行生物学特性的分析,继而利用该单抗进行免疫荧光标记和流式细胞术检测PD-L2在肿瘤细胞株和免疫细胞上的表达特性。结果显示,通过多次融合和反复筛选,成功获得一株特异性鼠抗人PD-L2(B7-DC)的杂交瘤,该杂交瘤分泌的单克隆抗体能特异识别人PD-L2分子。继而利用上述研制获得的单克隆抗体8F2进行免疫荧光标记和流式细胞术检测发现,PD-L2上调性表达在成熟的树突状细胞和调节性T细胞上。提示,成功地获得一株特异性鼠抗人PD-L2单克隆抗体,并对其生物学特性和表达谱进行初步分析,证明其识别抗原表位不同于商品化抗体,是一株新型鼠抗人PD-L2单抗,这为进一步研究PD-1/PD-L2信号通路在免疫应答中的生物学作用提供了有价值的物质基础。  相似文献   
5.
目的:研制特异性鼠抗人PD-L1单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人PD-L1分子的基因转染细胞L929/PD-L1为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/PD-L1细胞为抗体筛选细胞,L929/mock细胞为对照细胞,经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析,筛选稳定和持久分泌鼠抗人PD-L1 mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、Western blot、间接免疫荧光法和竞争结合抑制实验等方法对mAb进行生物学特性鉴定;继而体外实验分析mAb对T细胞增殖的影响。结果:成功获得3株鼠抗人PD-L1mAb,分别命名为11G8,2G5和5C3;对其生物学功能的研究结果显示,3株mAb均能识别活化T细胞表面PD-L1分子,和在体外显著促进T细胞的增殖。结论:获得的3株鼠抗人PD-L1功能性mAb,通过阻断PD-1/PD-L1抑制途径能够有效增强T细胞体外增殖,这为进一步研究PD-1/PD-L1信号通路提供了物质基础。  相似文献   
6.
为了借助FTOC体系探讨Flt3L对小鼠胸腺树突状细胞分化发育的影响。摘取15~16d龄胎鼠胸腺进行体外器官培养(胎鼠胸腺器官培养-FTOC),根据所使用培养基的不同实验分为两组:对照组(基础培养基)和Flt3L组(培养基中含有细胞因子Flt3L),在体外进行FTOC常规培养,12d后分别收集两实验组的胸腺细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子CD4、CD8、CD11c、Ia等的表达,通过光学显微镜观察细胞形态。骨髓来源的c-kit+造血干细胞通过悬滴培养方法种植入2-脱氧鸟苷处理过的胸腺,随后将胸腺放置于组织器官培养皿中所使用的培养基为基础培养基或加入细胞因子Flt3L的培养基,进行为期12d的FTOC常规培养。12d后收集不同条件下FTOC培养的胸腺细胞,通过流式细胞仪对胸腺细胞的表型进行分析;将在不同条件下FTOC培养获得的胸腺细胞进行MACS分选,从而获得胸腺树突状细胞(CD11c+DC),再与异源的CD4+T细胞进行混合淋巴细胞反应,通过MTT法检测T细胞的增殖情况。结果:在正常FTOC体系中,流式细胞仪检测结果和细胞形态学结果显示:Flt3L组胸腺DC有明显的增加,且FTOC联合悬滴培养体系中Flt3L组胸腺DC的生成率明显高于对照组;MTT检测结果也显示:没有CpG2006刺激时,胸腺DC刺激T细胞增殖的能力比较弱,但添加CpG2006刺激后,胸腺DC趋向于成熟表型,刺激T细胞增殖的能力有所增强。提示,Flt3L在小鼠胸腺DC的分化发育中发挥重要的调节作用,明显促进小鼠骨髓来源的c-kit+造血干细胞向胸腺DC的分化。  相似文献   
7.
《江苏医药》2012,38(2)
目的 研究过敏性紫癜(HSP)患儿淋巴细胞亚群的变化及其临床意义.方法 收集45例HSP患儿(A组),其中肾炎型15例(A1组),非肾炎型30例(A2组);另选25例健康儿童为对照组(C组).采用流式细胞术检测外周血中CD3+、CD3+ CD4+、CD3+ CD8+、CD3- CD19+、CD3- CD19+ CD23+以及CD3- (CD16+ CD56+)的表达水平.结果 与C组相比,A组CD3+T细胞数量、CD4+T细胞数量、CD4/CD8比例、CD3- (CD16+ CD56+)NK细胞数量均下降(P<0.05),而CD3- CD19+B细胞及CD3- CD19+ CD23+B细胞数量明显增加(P<0.05),其中A1组上述指标变化较A2组更为显著(P<0.05).结论 HSP患儿T、B和NK细胞数量和功能发生明显变化,表明免疫功能紊乱可能是导致肾脏损伤的重要原因之一.  相似文献   
8.
目的观察重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)和重组人白介素-11(rhIL-11)联合治疗极重度骨髓型急性放射病(ARS)比格狗的治疗效果,为临床救治提供依据。方法用4.5Gy-(60)Coγ射线照射比格狗建立极重度骨髓型ARS模型,随机分成照射对照组、综合对症组和细胞因子组。照射对照组不给予任何治疗,综合对症组给予包括输血、抗感染等对症治疗,细胞因子组在综合对症治疗基础上给予rhG-CSF和rhIL-11治疗3周,然后观察各组的血象变化、输血量、抗生素使用时间和动物的存活率等。结果照射后3组动物血象中各类细胞都呈急剧下降,细胞因子组治疗后血象基本恢复正常。细胞因子组的平均输血量和输血时间均显著少于综合对症组(P〈0.01),抗生素使用时间也较短(P〈0.05)。照后45d观察期内,存活率照射对照组为0%,综合对症组为80%,细胞因子组为100%,3组存活率有显著差异(P〈0.01)。结论综合对症基础上联合rhG-CSF和rhIL-11治疗极重度骨髓型ARS比格狗,能够促进骨髓造血功能的恢复,刺激血细胞较快地回升,显著减少输血量,缩短抗生素使用时间,并能提高照射狗的存活率。  相似文献   
9.
目的 评价共刺激分子B7-H4表达对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)过继免疫治疗胃癌患者后预后的影响.方法 采用回顾性队列分析156例胃癌的临床资料,并按其治疗情况分为对照组(81例,单纯化疗)和试验组(75例,化疗联合CIK细胞治疗).对胃癌患者组织进行B7-H4免疫组织化学染色,并比较B7-H4不同表达情况下,对照组与试验组治疗后无瘤生存率的差异.结果 对照组和试验组间各临床病理资料的差异无统计学意义(p〉0.05).两组术后中位无瘤生存时间分别为18.0个月和45.0个月(χ~2=11.631,P=0.001),术后中位总体生存时间分别为27.0个月和49.0个月(χ~2=10.907,P=0.001),差异均有统计学意义.86例B7-H4低表达者中,采用单纯化疗和CIK联合治疗后中位无瘤生存时间分别为32.0个月和62.0个月.差异有统计学意义(χ~2=4.663,P=0.03);70例B7-H4高表达者中,采用单纯化疗和CIK联合治疗后中位无瘤生存时间分别11.0个月和18.0个月,差异有统计学意义(χ~2=11.971,P=0.001).结论 采用化学治疗联合CIK细胞回输治疗胃癌,无论B7-H4高表达还是低表达,均可显著延长胃癌患者的无瘤生存时间.  相似文献   
10.
[摘要] 目的 重编程肝癌细胞系Huh7细胞为多潜能干细胞。方法 包装携带有Oct4、Sox2、Nanog、Lin28基因的慢病毒,将包装好的病毒共感染Huh7细胞,采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光、实时定量PCR,免疫组织化学等方法对诱导出的多潜能干细胞样克隆细胞进行鉴定。结果 Huh7细胞被重编程为多潜能干细胞样细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性,免疫荧光实验证明其表达多潜能因子,Oct4与TRA-1-60,qPCR实验证明其高水平表达内源性的多潜能相关基因及干细胞特异的microRNAs,体内分化实验结果表明iHuh7可以形成畸胎瘤。结论 通过携带四种多潜能因子的慢病毒介导的重编程, Huh7细胞可以被诱导为多潜能干细胞样细胞。  相似文献   
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