新型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性研究

目的 观察新型乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原中蛋白（MHBs)核酸疫苗的免疫原性。方法 以新型人体应用载体质粒pSW3891构建MHBs核酸疫苗（pSW3891/MHBs/adr)，对照组和实验组Balb/c小鼠分别基因枪法免疫对照载体质粒（pSW3891)和MHBs核酸疫苗，采用酶联免疫吸附试验检测抗HBs,LDH释放测定法检测小鼠特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤活性。结果 MHBs核酸疫苗可在体外高效表达，免疫小鼠后可产生高滴度抗HBs，血清阳性终点滴度达1：97200,小鼠脾细胞HBs特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性达78.81%。结论 新型MHBs核酸疫苗在Balb/c小鼠实验中表现出良好的体液和细胞免疫原性。     

密码子优化的中国HIV-1流行亚型gp120共识序列核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的:构建能表达密码子优化的中国HIV-1流行亚型AE、Bc和B'gp120共识序列的核酸疫苗,并研究其免疫原性.方法:根据HIV-1的分子流行病学资料和包膜糖蛋白的氨基酸序列分析,设计了针对中国流行的AE,BC和B'(ThB)亚型的gp120共识序列.按哺乳动物细胞偏好的密码子对AE.BC和ThB 3个亚型的gp120共识序列分别进行密码子优化,合成优化基因.将密码子优化的gp120基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891,构建重组质粒核酸疫苗.将重组质粒转染293T细胞,并以重组质粒疫苗免疫新西兰兔.应用蛋白质免疫印迹法检测转染细胞中gp120蛋白的表达.ELISA方法检测免疫后兔血清中gp120特异性抗体的产生.结果:3个密码子优化的gp120核酸疫苗,均能正确表达gp120.这些gp120核酸疫苗免疫家兔后,能产生HIV-1包膜糖蛋白特异性的抗体.结论:成功构建3个密码子优化的、表达HIV-1中国流行亚型AE,BC和ThB的共识序列的gp120核酸疫苗,能诱导HIV-1包膜蛋白特异的免疫反应.     

禽流感 HA 基因密码子优化的 DNA 疫苗构建及其免疫原性的初步研究

 目的 构建H5 N1亚型禽流感病毒株密码子优化的血凝素（HA）DNA疫苗并研究其免疫原性。方法 应用MacVector软件分析H5N1亚型禽流感病毒A/Viet Nam 1203/04株HA（H5-VN HA）基因序列，对这些序列进行密码子优化处理，人工合成优化后的H5-VN HA基因。将密码子优化H5-VN HA基因与pSW3891质粒连接，并以人组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）信号肽取代H5-VN HA信号肽，构建成表达H5-VN HA基因的重组质粒，命名为HA-VN.tPA（即密码子优化的H5-VN HA基因DNA疫苗）。以HA-VN.tPA转染293T细胞，应用蛋白质印迹法检测转染细胞中HA蛋白的表达。以HA-VN.tPA对2只新西兰兔进行DNA免疫，用ELISA方法检测分析免疫后兔血清中HA特异性抗体的产生。结果 密码子优化的H5-VN HA基因中哺乳动物细胞偏爱的密码子频率高于野生型H5-VN HA基因。蛋白质印迹法分析结果表明，HA-VN.tPA转染293T细胞后，细胞裂解液中检测出HA蛋白的表达。ELISA分析结果表明，以HA-VN.tPA免疫3次后，实验兔体内产生了较高水平的HA特异性抗体（血清中平台期抗体滴度达1:13 500）。结论 成功构建了H5N1亚型禽流感病毒密码子优化的HA 基因DNA疫苗，该疫苗可引导免疫后宿主体内产生高滴度特异性抗体。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响.方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT.构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点).脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响.结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到.adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,最高滴度均达到1∶102 400;dG123几乎无抗体反应(＜1∶200).结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响.Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微.Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生.     

新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗在中国猕猴体内免疫原性初步研究

目的:观察乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗在中国猕猴体内的体液和细胞免疫应答。方法:实验用中国猕猴实验组、对照组各2只,分别在第0、8、16、24、48周肌肉注射法接种核酸疫苗(pSW3891/MHBs)或对照载体(pSW3891)。ELISA法检测中国猕猴血清抗-HBs,CFSE-PI染色FCM(流式细胞术)法测定中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应。结果:实验组中国猕猴血清抗-HBs滴度在72周达到最高峰,最高滴度分别为1∶6400和1∶12800,对照组抗-HBs滴度始终保持在1∶50。实验组中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应明显增强,细胞分裂指数分别为18.64和14.70,而对照组细胞分裂指数分别为1.62和2.61。结论:建立了CFSE-PI染色流式细胞仪检测法来检测中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg抗原特异性增殖反应,方法创新,实用可靠。新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗pSW3891/MHBs在中国猕猴体内能产生良好的特异性体液和细胞免疫应答。     

新型乙型肝炎病毒核心区核酸疫苗的免疫原性研究

目的观察新型乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)核酸疫苗的免疫原性。方法应用新型人体应用载体质粒pSW389l构建HBcAg核酸疫苗(pSW3891／HBc)，对照组和实验组Balb／c小鼠分别以基因枪法免疫对照载体质粒(PSW3891)和HBcAg核酸疫苗，采用酶联免疫吸附试验检测抗HBc，乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法检测小鼠HBcAg特异性cTL杀伤活性。结果HBcAg核酸疫苗可在体外293T细胞中高效表达，免疫小鼠后可产生高滴度抗HBc(1：97200)，免疫鼠脾细胞HBc特异性CTL杀伤活性达73．25％。结论新型HBcAg核酸疫苗在Balb／c小鼠实验中表现出良好的体液和细胞免疫原性。