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1.
目的:建立小鼠成熟脂肪细胞血管基质部分(stromal vascular fraction,SVF)与小鼠肝细胞(Hepa1?6)共培养模型,研究成熟脂肪细胞对肝细胞脂质堆积以及代谢的影响。方法:从小鼠皮下脂肪分离提取原代SVF细胞,经体外分化成熟后,以Transwell小室建立成熟SVF细胞和Hepa1?6细胞间接共培养48 h体系。应用逆转录?聚合酶链反应法(RT?PCR法)检测SVF细胞PPARγ和PGC?1α等分化相关基因及Hepa1?6细胞CD36、FATP2、GPAT1等脂代谢相关基因的表达。酶法检测经共培养后的Hepa1?6细胞甘油三酯水平。结果:小鼠原代SVF细胞经诱导成熟后,出现明显较大脂滴;成熟SVF细胞中PPARγ和PGC?1α等分化标志物较未分化SVF细胞显著升高;Hepa1?6细胞甘油三酯水平明显高于未共培养组;Hepa1?6细胞GPAT1、CD36基因表达水平明显升高。结论:已成功建立成熟脂肪细胞与Hepa1?6细胞Transwell共培养模型。肝细胞与成熟脂肪细胞共培养可以诱导其脂质堆积增加,该过程可能通过上调肝细胞中CD36 和GPAT1的表达水平增加脂肪酸的吸收和甘油三酯的合成通路实现。  相似文献   
2.
目的:探索去泛素化酶YOD1在肝脏营养代谢中发挥的作用。方法:通过Q?PCR检测高脂饮食C57BL/6小鼠、db/db小鼠肝脏中以及油酸(oleic acid,OA)处理后的Hepa1?6细胞内,YOD1的表达情况。在C57BL/6小鼠中,通过Q?PCR法检测YOD1的组织分布及不同营养状态下的表达情况。对Hepa1?6细胞中给予OA处理,通过甘油三酯试剂盒检测细胞内甘油三脂含量,并利用油红染色观察细胞内脂滴。经Q?PCR和蛋白免疫印迹法检测细胞内相关基因的mRNA及蛋白水平。结果:短期高脂饮食后,肝脏中YOD1的mRNA水平显著下降。而与对照组db/+小鼠相比,db/db小鼠肝脏中YOD1的mRNA水平无变化。但是,经OA处理后,Hepa1?6细胞内的YOD1的mRNA水平明显减少。另外,YOD1主要表达于肝脏中。小鼠禁食后,肝脏YOD1的mRNA水平显著增加,而再喂食后显著下降。此外,过表达YOD1的Hepa1?6细胞中OA诱导的脂质堆积明显减少,且SREBP?1c的剪切被抑制。结论:本研究初步发现,去泛素化酶YOD1的表达水平受营养状态调控,并通过抑制SREBP?1c的剪切影响肝细胞的脂代谢。  相似文献   
3.
目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。  相似文献   
4.
李原  陈鸿  朱云霞  杨楠  王尧 《江苏医药》2012,38(21):2501-2503,2492
目的 探讨小分子RNA(siRNA)干扰CASK基因表达对大鼠INS-1细胞胰岛素分泌的影响.方法 用脂质体lipofectamine 2000将针对靶基因CASK合成的特异性siRNA片段转染INS-1细胞.实时定量PCR及Western blot检测CASK基因表达变化,进行有效干扰片段的筛选.放射免疫法检测钾离子刺激胰岛素分泌(KSIS)功能的改变.结果 转染100 nM siRNAs 48 h后,INS-1细胞中CASK基因表达明显降低(P<0.01),KSIS功能显著降低(P<0.01).结论 靶向siRNA可以特异性地抑制INS-1细胞中CASK基因表达,从而抑制钾离子诱导的胰岛素分泌.  相似文献   
5.
重组腺相关病毒介导的TIMP-1载体的构建及鉴定   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:构建及鉴定载入金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的重组腺相关病毒载体。方法:应用基因重组的方法构建含全长TIMP-1的重组腺相关病毒骨架质粒(pAAV—TIMP-1),利用磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体质粒共转染入HEK293细胞中,分别装配成rAAV—TIMP-1和rAAV—hrGFP,将rAAV-hrGFP转导HT1080细胞测定重组病毒的滴度,Westernblot方法检测rAAV—TIMP-1在HT1080细胞中的表达情况。结果:成功构建rAAV—TIMP-1,病毒滴度达到10^9 TU/ml,转导细胞后,转导组TIMP-1的表达水平高于对照组。结论:构建的rAAV—TIMP-1,为基因修饰胰岛移植提供了新的手段。  相似文献   
6.
目的:研究脱氧胆酸对人胆管癌细胞凋亡和增殖的影响;以及该影响的细胞内信号转导途径。方法:用四甲基偶氮唑蓝[3鄄(4,5鄄dimethylthiazole鄄2yl)鄄2,5鄄diphenylte鄄trazoliumbromid,MTT法]比色法和流式细胞仪技术(flowcytometry)检测脱氧胆酸对QBC939细胞增殖和凋亡的影响。用荧光素酶报道基因技术检测在脱氧胆酸作用前后核转录因子(nuclearfactorkappaB,NF鄄κB)活性的改变。再将NF鄄κB的天然抑制因子IκB转染人胆管癌细胞系QBC939,观察用IκB抑制NF鄄κB后肿瘤细胞的增殖和凋亡的情况。结果:脱氧胆酸能抑制胆管癌细胞的增殖、促进其凋亡,这一抑制作用的机制是通过抑制NF鄄κB实现的,用NF鄄κB的抑制因子IκB作用于QBC939细胞,所起的作用与脱氧胆酸相似。结论:脱氧胆酸能通过抑制NF鄄κB的活性,抑制QBC939细胞的增殖,并促进其凋亡。  相似文献   
7.
目的:构建小鼠成红细胞白血病病毒E26癌基因同系物1(V-Ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1,Ets-1)重组腺病毒,并验证其对小鼠原代胰岛及胰岛β细胞系INS-1的感染活性和Ets-1蛋白表达活性?方法:以小鼠胰岛β细胞系MIN6的cDNA为模板,PCR扩增Ets-1基因的编码区序列(coding sequence,CDS)区,纯化后经限制性内切酶切割和连接反应插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒上,构建成pAdTrack-CMV-Ets-1质粒?将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,鉴定出阳性克隆?扩增并抽提阳性克隆质粒,用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,经包装得到AdV-Ets-1重组腺病毒?相应对照病毒AdV-GFP由相同方法构建?腺病毒经纯化后,感染小鼠原代胰岛及INS-1细胞,并用Western blot检测Ets-1蛋白表达水平?结果:腺病毒构建成功,并具有高感染率及高蛋白表达能力?结论:成功构建了小鼠Ets-1腺病毒,为进一步研究Ets-1基因在原代胰岛中的功能提供基础?  相似文献   
8.
目的 比较间歇刺激法和浓度梯度递增法对雌激素受体(estrogen receptor,ER)阴性的乳腺癌耐药细胞株的建立,为进一步探讨ER阴性乳腺癌可能的耐药机制.方法 采用间歇刺激法和浓度梯度递增法,用紫杉醇诱导6个月,分别建立了耐药细胞系231 TIM10和231 TAX8,并用倒置相差显微镜、MTT法、Weste...  相似文献   
9.
目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。 方法:实验于2005—03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。 结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。 结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。  相似文献   
10.
目的:明确囊泡分选蛋白13A(vacuolar protein sorting 13 homolog A,VPS13A)在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embry- onic fibroblast cells,3T3-L1)分化过程中的表达水平;探索VPS13A对3T3-L1细胞的影响。方法:利用Western blot及Q-PCR法检测3T3-L1细胞在分化过程中VPS13A的表达,利用CRISPR/Cas9系统构建VPS13A稳定敲降细胞系,Western blot和油红染色检测VPS13A敲降后对3T3-L1细胞分化的影响。结果:VPS13A的表达在3T3-L1分化过程的早期降低,在分化的后期升高。敲降VPS13A后,3T3-L1细胞中脂滴增多,参与调控脂肪细胞分化基因的表达水平升高。结论:在3T3-L1细胞中VPS13A的表达水平在分化过程中被调控,敲降VPS13A可以促进3T3-L1细胞的分化成熟。  相似文献   
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