优化酶消化法体外培养及鉴定SD大鼠的成骨细胞

背景:体外成骨细胞的培养技术已经有了很大的发展.但是,在培养过程中,如果胰蛋白酶的消化时间过长,成骨细胞膜便易受到损伤;同时,传统的培养方法存在所获得的成骨细胞数量少、纯度不高等不足.因此,有必要探求一种新的体外培养成骨细胞的方法.目的:优化成骨细胞在体外条件下的培养方法并对其进行鉴定.设计:观察性实验.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/05在暨南大学附属第一医院骨科完成.选用出生24h的SD大鼠8只,由南方医科大学实验动物中心提供,雌雄不拘.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验用Ⅱ型胶原酶由美国Sigma公司分装,胰蛋白酶为Sigma公司产品,碱性磷酸酶试剂盒由南京建成生物制品公司生产,SABC-1021试剂盒由武汉博士德公司进口分装.方法:挑选24h之内的新生SD乳鼠麻醉后处死,无菌条件下取出颅骨,剔除附着的结缔组织及骨膜,D-Hank's液冲洗3次.不强调对颅骨内、外膜,骨缝连接处等附着的结缔组织及颅顶的透明软骨结节等进行反复多次的剔除,避免操作时间过长影响细胞的存活率.结合0.1%Ⅱ型胶原酶来消化SD乳鼠颅骨,减少并严格控制胰蛋白酶的消化时间.组织块经0.25%胰蛋白酶消化20 min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60 min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化.主要观察指标:应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜观察成骨细胞形态特点.采用碱件磷酸酶Gomori钙钴法染色、钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色方法进行鉴定成骨细胞生物学特性.结果:原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,细胞呈多角形或梭形,具有多个突起可互相连接,细胞核较幼稚,细胞器丰富,具有典型的成骨细胞形态特征.体外培养的成骨细胞可分泌碱性磷酸酶,改良钙钴法染色阳性率可达90%,并可形成钙结节,Ⅰ型胶原染色阳性,具有成骨细胞的生物学功能.结论:实验用优化后的酶消化法分离、培养的SD大鼠成骨细胞具有典型的成骨细胞生物学特征.     

股前外侧肌皮瓣修复小腿截肢残端软组织缺损

目的 探讨股前外侧肌皮瓣修复小腿截肢残端软组织缺损,保留小腿长度或膝关节以利于假肢装配.方法 2013年4月-2016年11月,应用股前外侧肌皮瓣对小腿截肢残端软组织缺损进行修复4例,其中游离肌皮瓣3例,带蒂肌皮瓣1例.患者均为男性,截肢肌创面位于小腿近端,年龄8~48岁,平均20岁,创面面积7.0 cm×6.0 cm^25.0 cm×10.0 cm.一期清创后二期修复,肌皮瓣面积13.0 cm×10.0 cm^28.0 cm×12.0 cm,保留胫骨长度5.2~9.4 cm.结果 肌皮瓣全部成活,1例肌皮瓣边缘出现浅表感染经换药处理后愈合,供区无并发症.所有患者随访12~37(平均19)个月,末次随访时皮瓣血运好、质地柔软、耐磨.皮瓣感觉恢复程度:S22例, S31例,S3+1例. 6 min步行测试:Ⅳ级2例,Ⅲ级2例;Stanmore运动分级:V级2例,Ⅳ级2例.结论 股前外侧肌皮瓣是修复小腿截肢残端软组织缺损的理想皮瓣.     

预防创伤后肘关节异位骨化的研究进展

创伤后肘关节异位骨化在临床中相当常见,若肘关节出现严重的异位骨化,只有通过手术才能重新恢复关节的活动功能,且术后易复发,疗效较差。因此,创伤后肘关节异位骨化重在预防。创伤后肘关节异位骨化的预防方法多种多样,非甾体类药物及放射治疗在临床中应用较多,许多方法仍处于动物实验研究或假说阶段,目前尚缺乏高效安全的预防方法。本文主要通过对创伤后肘关节异位骨化预防方法的总结,明确目前相对有效的方法,为将来研究创伤后肘关节异位骨化的预防方法提供指导依据。     

脑性瘫痪患者肢体解痉、矫形与功能重建的手术治疗研究进展

目的 总结脑性瘫痪（脑瘫）患者在肢体解痉、矫形与功能重建等手术治疗方面的研究进展。方法 在中国知网、万方数据、PubMed等中、英文数据库,检索2000年1月—2021年6月发表的关于脑瘫诊断和治疗的相关文献,剔除内容不符、质量较低、证据等级不高、重复研究的文献,最终纳入47篇文献,从肢体解痉、矫形和功能重建3个方面对脑瘫的手术治疗进行总结、分析。结果 关于脑瘫的手术治疗,目前可供选择的术式有很多。（1）解痉手术：包括选择性脊神经后根切断术（SPR）和选择性周围神经切断术（SPN）。SPR手术可广泛降低肢体肌张力,更适合肢体强直型痉挛;而SPN降低肌群中单块肌肉张力的效果确切、创伤小,适用于局灶性痉挛。（2）矫形手术：通过肌腱转位、延长或紧缩调整肌张力、松解痉挛、缓解或矫正畸形,手术方式包括跟腱延长术、腘绳肌松解、胫后肌延长、胫前肌移位、内收肌切断术等。临床上矫形手术常作为解痉手术的重要补充,脑瘫患者往往需先接受SPR/SPN解除痉挛,再进行矫形手术。（3）肢体功能重建手术：包括神经段移植嵌入嫁接术、带血管的神经移位嫁接术及神经束间侧侧缝合术等改良周围神经移位术,可重建患者部分运动功能和感觉功能。结论 脑瘫的手术治疗非常重要,个体化制定分期手术方案,联合应用肢体解痉、矫形和改良神经移位术,对于缓解中枢神经系统损伤后的肢体痉挛、矫正畸形及重建肢体部分功能有积极的作用。     

纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性

背景:新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似,其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长,并显示良好的相容性?目的:评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性.设计:单一样本观察.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成.选取10只4周龄雌性SD大鼠,SPF级,体质量200 g,由广东省实验动物中心提供(许可证号为SCXK(粤)2003-0002).实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供.方法:①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测.②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架.③取生长良好的P3代,与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养,以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性. 主要观察指标:①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定.②纳米材料及细胞复合2,4,8 d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况.③细胞对材料黏附率的测定.④细胞与材料复合5 d检测细胞周期及活力.结果:①细胞表面抗原标志检测结果:CD29表达为90.86%,CD106表达为73.38%,CD44表达为82.61%,CD34表达为0.76%,CD45表达为0.60%.②细胞与材料相容情况:扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构,材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔,彼此相互交通.应用质量法测得的孔隙率为85%～90%,孔径为50～300 μm,平均150 μm.骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2 d,细胞呈球形散在分布;4 d后细胞呈梭形,延展爬行且有伪足与材料表面锚靠;8 d时细胞增殖,相互间融合,并有大量的细胞外基质分泌,大部分材料颗粒被覆盖.③细胞对材料黏附率:细胞-支架复合物共培养2及6 h,骨髓基质干细胞在纳米壳聚糖-胶原纤维支架的黏附率均高于单纯纳米壳聚糖支架.④纳米壳聚糖-胶原纤维支架与单纯纳米壳聚糖支架的细胞、细胞周期特点比较:纳米壳聚糖-胶原纤维支架细胞活力为96.67%,细胞周期G0-G1为90.81%,G2-M为0.52%,S为8.66%,G2/G1为1.81.单纯纳米壳聚糖支架细胞活力为95.27%,细胞周期G0-G1为87.14%,G2-M为9.69%,S为4.16%,G2/G1为1.80.结论:纳米壳聚糖-胶原支架与骨髓基质干细胞有良好的组织相容性,可用来做组织工程生物材料.     

股骨粗隆间骨折术后早期负重在适宜人群中的效果

目的 观察股骨粗隆间骨折术后早期负重在适宜人群中的康复疗效。方法 2017年4月至2018年12月,本院骨科Evans-Jensen Ⅱ型股骨粗隆间骨折行股骨近端防旋髓内钉(PFNA)内固定术后,且骨折复位符合股内侧皮质阳性支撑(PMCS)的患者45例随机分成对照组( n= 22)和试验组(n = 23)。对照组于术后6周行耐受性负重,试验组于术后48 h内行耐受性负重,均由每次10 min、每天3次逐渐递增至每次20 min、每天5次,直到骨折临床愈合。比较两组的住院时间、住院费用、骨折临床愈合时间和并发症,术后6周、3个月、6个月比较疼痛视觉模拟评分(VAS)和Harris髋关节评分。结果 试验组住院时间明显短于对照组(t =3.716, P < 0.01);住院费用低于对照组,但无显著性差异( t = 1.540,P > 0.05);骨折临床愈合时间显著短于对照组( t =6.248, P < 0.001)。试验组并发症发生率低于对照组,但无显著性差异( χ² = 2.198, P > 0.05)。术后6周、3个月和6个月,两组VAS均无显著性差异( t < 1.330, P > 0.05)。试验组术后6周Harris髋关节评分显著高于对照组( t = -5.115, P < 0.001),两组术后3个月和6个月无显著性差异(| t| < 1.799, P > 0.05)。 结论 Ⅱ型股骨粗隆间骨折PFNA内固定术后,且骨折复位符合PMCS的患者于术后48 h内行耐受性负重可减少住院时间,促进骨折愈合和早期髋关节功能的康复。     

透明质酸/壳聚糖复合支架的制备及其力学性能评价

目的　模拟天然骨组织的结构和成分,寻找适合骨组织工程的新型支架材料。 方法 以透明质酸、壳聚糖为基质材料,在微酸性环境中以一定配比与氯化钙和磷酸二氢钠混合,冷冻干燥得到多孔复合支架材料。然后在乙醇/水/尿素环境中分别陈化0、2、4、8、12和24 h,以生成产物钙磷盐前驱体转变为羟基磷灰石,最终制备出一种深度矿化的透明质酸/壳聚糖复合支架。并通过SEM、EDS等对支架进行表征,研究支架的形貌、成分及力学强度等性能。 结果 SEM观察显示,支架材料具有比较均匀的多孔结构,孔径大小为100~200 μm。EDS结果表明,复合支架在一次冻干之后形成的是磷酸氢钙（DCPD）,随着陈化时间的延长,DCPD逐渐向羟基磷灰石（HAP）转化。而压缩强度则表明经过原位矿化的支架力学性能显著提高。 结论 通过该法得到的透明质酸/壳聚糖复合支架可作为骨组织工程的新型支架材料。     

S100A4在类风湿关节炎滑膜中的表达及其对成纤维样滑膜细胞分泌VEGF促进血管生成的影响

目的:研究S100钙结合蛋白A4(S100A4)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者和正常人膝关节滑膜中的表达水平,以及S100A4对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs)促进血管生成的影响。方法:滑膜分别取自RA患者(RA组)及正常人(control组)膝关节,免疫组化法观察S100A4和VEGF蛋白在2组滑膜中的表达情况。RAFLSs分离自活动性RA滑膜;ELISA法检测S100A4刺激RAFLSs分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的作用;用rh S100A4孵育RAFLSs的条件培养基作用于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),检测S100A4体外血管生成能力。结果:S100A4及VEGF蛋白在RA组滑膜中高表达(P0.05),rh S100A4显著刺激RAFLSs分泌VEGF,呈时间和剂量依赖性(P0.05);rh S100A4孵育RAFLSs的条件培养基可促进HUVECs在体外形成管腔。结论:S100A4蛋白在RA患者膝关节滑膜中高表达,S100A4可通过促进RAFLSs分泌VEGF来刺激滑膜血管生成。这些结果提示S100A4可作为治疗RA的潜在靶点。     

人脐带间充质干细胞定向诱导分化成类神经元的实验研究

目的:采用不同细胞因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化成类神经元,为脐带间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供理论依据。方法:采用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,采用流式细胞术鉴定细胞。取第5代细胞随机分成A、B、C、D 4组,在A组基础培养基中加入b FGF,B组中加入b FGF和BDNF,C组中加入b FGF、BDNF和BHA诱导培养,D组为对照组,使用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养基培养。诱导2周后采用实时荧光定量PCR检测细胞的nestin、NEFH和GFAP mRNA表达情况,并通过原子力显微镜观察细胞超微结构的的变化。结果:Ⅱ型胶原酶消化法能成功分离人脐带间充质干细胞。通过流式细胞术检测第3代细胞发现,细胞均强表达CD29、CD44和CD105,而CD34、CD45和HLA-DR均未见表达。经定向诱导分化成类神经元后,原子力显微镜观察细胞表面突起增多,实时荧光定量PCR检测显示nestin在A、B、C组均呈阳性表达,NEFH在A、B组呈阳性表达,而GFAP在A、B、C、D 4组均不表达。A、B组n EFH和nestin表达具有显著差异(P﹤0.05)。结论:本实验成功分离培养人脐带间充质干细胞,所培养的细胞扩增迅速,生物学性状稳定;与b FGF单独处理相比,b FGF联合BDNF更能有效诱导人脐带间充质干细胞分化成类神经元。     

糖尿病对骨代谢影响的基础研究进展

近年来,一系列临床研究及动物实验结果表明,糖尿病与骨质疏松症的发生及发展进程密切相关,糖尿病可通过不同的分子机制对骨代谢产生不良影响。相关的机制研究表明糖尿病通过脂肪因子、晚期糖基化终末产物、骨硬化蛋白、胰岛素、胰岛素生长因子-1、促炎因子、骨髓脂肪组织及胰高血糖素样肽1等因素直接或间接地参与和诱导了骨质疏松症的形成和发展。本研究就糖尿病对骨代谢影响的基础研究,糖尿病性骨质疏松症的分子机制进行综述。