肝癌细胞微细胞介导染色体转移方法学的建立与探讨

目的建立肝癌细胞微细胞介导染色体转移方法，为肝癌转移抑制基因的染色体功能定位建立技术平台。方法人单染色体供体细胞通过微核化、出核、融合步骤将随机标记有耐药neo基因的正常人8号染色体导入到大鼠肝癌高转移细胞系C5F中，对微细胞杂交克隆进行药物筛选和单细胞克隆，并填序列标签位点-PCR和全染色体涂染荧光原位杂交方法验证人染色体转移的结果。结果获得具有G418和HAT双重抗性的微细胞杂交细胞，通过单细胞分离克隆方法获得15个具有双重抗性的微细胞杂交克隆，序列标签位点-PCR结果发现导入染色体的随机片段丢失，全染色体涂染荧光原位杂交结果发现导入的人8号染色体与大鼠染色体发生了稳定的重组。结论成功建立微细胞介导的染色体转移技术，为肝癌转移抑制基因的染色体功能定位奠定了技术基础。     

与高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽对人肝癌细胞株体外侵袭表型的影响

目的 研究与高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽(AWYPLPP肽)对不同转移潜能人肝癌细胞株体外侵袭表型的影响.方法 采用侵袭实验探讨AWYPLPP肽对不同转移潜能的人肝癌细胞株体外侵袭表型的影响;利用迁移实验、黏附实验和明胶酶谱实验研究其可能的作用机制,采用单因素方差分析检测结果.结果 在AWYPLPP肽浓度为0.10～100.00 μmol/L时,其能显著促进高转移潜能人肝癌细胞株HCCLM3的侵袭能力,呈剂量效应关系;在浓度为100.00μmoL/L时,其能促进其他高转移潜能人肝癌细胞株MHCC97、MHCC97H和HCCL,M6的侵袭能力(F=4.84,8.19,25.42,P<0.05),对低转移潜能人肝癌细胞株MHCC97L、PLC/PRE/5和Hep3B的侵袭能力无明显影响.迁移实验和黏附实验表明,AWYPLPP肽对HCCLM3的迁移和黏附能力无影响;明胶酶谱实验发现,AWYPLPP肽作用后HCCLM3细胞分泌活性型基质金属蛋白酶9(MMP-9)明显增加.结论 AWYPLPP肽能促进高转移潜能人肝癌细胞株体外侵袭能力,其作用的机制可能与活性型MMP-9分泌增加有关.     

人肝癌转移抑制基因存在的功能研究

目的 寻求人8号染色体上存在肝癌转移抑制基因的功能证据.方法 前期通过微细胞介导的染色体转移方法(MMCT),将正常人8号染色体导入到大鼠肝癌高转移细胞株C5F中获得的微细胞杂交克隆Ne08/C5F-1～10和大鼠肝癌细胞株CSF,分别被接种到6～7周龄雌性BALB/CA裸鼠皮下进行自发转移实验,观察皮下成瘤及肺部大体转移灶形成情况,肺组织连续切片并计数镜下转移灶,结果进行单因素方差分析.结果 所有微细胞杂交克隆均能皮下成瘤,微细胞杂交克隆的自发转移实验发现有6个杂交克隆出现肺转移表型的明显抑制(P<0.05),其中2个杂交克隆肺转移表型发生完全抑制.结论 人8号染色体对大鼠肝癌高转移细胞株CSF的成功导入改变了CSF的转移表型,提供了人8号染色体上存在肝癌转移抑制基因的直接的功能证据.     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

Objective To investigate the effects of Pseudomonas aeruginosa vaccine (PA) on proliferation and invasiveness of the hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L with metastatic potential. Methods Proliferation, growth curve, plate efficiency, flow cytometry, transwell invasion assay, cell motility assay, scarification test, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) protein activity were evaluated after cells were treated with PA at various concentrations. Results PA can inhibit the proliferation and plate efficiency of MHCC97L cell markedly in a dose-dependent manner. The IC50 of cells treated with PA for 48 h and 72 h was 3.1 ×108/ml and 1.9 × 108/ml, respectively. The doubling time increased and plate efficiency decreased gradually when cells treated with 0.5 × 108/ml, 1 × 108/ml and 2 × 108/ml PA (P＜0.01). PA could induce cell cycle arrest at the G1 phase in a dose-dependent manner by flow cytometric analysis. The average amount of invading cell per field in cell invasion assay and motility assay were 4. 8 ± 1.3 and 8. 8±2.2 when cells treated with 1× 108/ml PA, which was significantly lower than that of control group (8. 6±2. 1 and 15. 6±1.2 ) (P＜0.01) Scarification test showed that the metastatic ability of cells treated with 1 × 108/ml PA significantly lower than that in the control group. Comparison between cells treated with 1 × 108/ml PA and control group, no remarkable difference was found regarding expression of VEGF and MMP2 in supernatant of cell culture. Conclusion PA can inhibit proliferation and plate efficiency of HCC cell line MHCC97L, which is in part mediated by the cell cycle arrest at the G1 phase. PA could inhibit invasiveness of HCC cell line MHCC97L, which is unrelated to the VEGF and MMP2 protein activity.     

肿瘤表观遗传与代谢研究进展

表观遗传学是研究在基因核苷酸序列不发生改变的情况下基因表达可遗传的变化的一门学科,是生命科学领域的热点学科。其中,基于表观遗传学的肿瘤治疗更是近年来研究的热点前沿。本文从DNA与RNA的甲基化（包括甲基化介导的基因表达调控）、组蛋白修饰（与调控基因的相互作用交流）、染色质重塑相关基因的表达调控、代谢重编程及基于表观遗传调控的肿瘤治疗等几个方面对近年来肿瘤表观遗传热点问题与相关重大进展进行总结和讨论,以期为肿瘤的基础研究和临床治疗提供一定的借鉴。     

不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异表达

目的对比观察不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异性表达。方法Pre- mier软件设计18对趋化因子受体引物,RT-PCR分析SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM6细胞侵袭转移潜能逐渐增强的人肝癌细胞株趋化因子受体谱。结果4组不同转移潜能细胞株趋化因子受体表达谱存在明显差异（P＜0．01）,其中CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐降低。HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CCR12及XCR1比SMMC-7721表达明显降低甚至缺失（P＜0．01）,而CXCR1（P=0．006）、CXCR5（P=0．003）表达高于低转移潜能组SMMC-7721。MHCC97-H和MHCC97-L比较,除CXCR2、CXCR6、XCR1外差异均有统计学意义,其中CCR1（P=0．002）、CCR2（P=0．004）、CCR5（P=0．046）表达高于MHCC97- L。CXCR4在模板减量时只能在SMMC-7721组检测到。结论高低转移潜能肝癌细胞株趋化因子受体表达在mRNA水平存在差异性表达,与肝癌细胞株差异性转移潜能相关。     

lncRNAs参与基因表达调控机制的研究进展

长链非编码RNAs (long non-coding RNAs,lncRNAs)是一组内源性、长度超过200 nt、缺少特异完整的开放阅读框(open reading frame,ORF)、无或很少有蛋白编码功能的RNAs分子.近年来的研究发现,IncRNAs与许多重要的生物学过程相关,如基因组印记、细胞分化、免疫反应等.lncRNAs在表观遗传水平、转录水平和转录后水平等多个层面调节基因的表达,通过介导染色质重塑和组蛋白修饰、干扰转录、调节选择性剪接模式、生成小RNAs、调节蛋白质活性、改变蛋白质定位等方式,参与机体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控.关于lncRNAs参与基因表达调控的机制有待进一步研究,这将有助于深入理解疾病的发病机制,为寻找疾病分子标记物、药物靶点提供新的方向.     

大鼠肝癌自发肺转移裸鼠模型的建立

目的　建立大鼠肝癌细胞系自发性肺转移裸鼠模型。方法　大鼠肝癌细胞系C5F皮下接种 4周龄雄性和 7周龄雌性BALB/CA裸鼠 ,观察皮下成瘤及肺部和腹腔脏器的大体转移灶形成情况 ,取可能转移的器官作组织学检查 ,肺组织连续切片并计数镜下转移灶。结果　裸鼠皮下成瘤率 10 /10 ,雌性裸鼠中肺表面肉眼可见明显转移灶 ,转移率为 6/6,肺表面大体转移灶中位数45 ,镜下转移灶中位数 75 5个 /裸鼠 ,腹腔及其脏器均未见转移灶。雄性裸鼠未见大体和镜下转移灶。结论　该细胞系在雌性BALB/cA裸鼠中能充分表达自发转移潜能 ,肺脏是其优势转移器官。成功建立的大鼠肝癌细胞自发肺转移裸鼠模型为肝癌转移抑制基因的染色体功能定位研究提供了适宜的动物模型。     

EGFL7的重组表达及其抗体制备和初步应用

目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关。本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平。结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EG-FL7。并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质。结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究。     

消炎痛抑制肝细胞肝癌生长转移的研究

目的 观察消炎痛(Indomethacin)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖侵袭的影响和对裸鼠肝癌生长和转移的抑制作用.方法 (1)体外实验:采用0.2 mmol/L的消炎痛分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、侵袭实验、运动实验和血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达[酶联免疫吸附试验(ELISA)].(2)体内实验:建立转移性人肝癌裸鼠原位模型后,将裸鼠随机分为对照组和消炎痛组.6周后处死动物,测量肿瘤体积,计算抑瘤率、肺转移灶数目及肺转移率.免疫组织化学方法检测VEGF、MMP-2、环氧合酶-2(COX-2)蛋白的表达.结果 (1)体外实验:0.2mmol/L消炎痛明显抑制MHCC97L细胞增殖(P值均＜0.01),消炎痛组穿过人工基底膜(侵袭实验)和上室底膜(运动实验)的细胞数分别为2.2±1.3和4.4±1.1,明显低于对照组(11.4±1.9和12.8±1.8,P值均＜0.01);ELISA法检测发现,消炎痛组VEGF蛋白和MMP-2蛋白含量和对照组比较明显降低(P值均＜0.01).(2)体内实验:对照组、消炎痛组肿瘤体积分别为(1700 ±422)mm3 和(1170±585)mm3(P＜0.05),肺转移率分别为75%和50%(P＞0.05),平均肺转移灶数目分别为2.92±2.07和1.33±1.56(P＜0.05);与对照组比较,消炎痛组的抑瘤率为31.2%.免疫组织化学染色显示,消炎痛组VEGF、MMP-2、COX-2蛋白的表达和对照组比较均有降低(P值均＜0.01).结论 在一定条件下,消炎痛可抑制肝细胞肝癌的生长转移,其作用和抑制VEGF蛋白和MMP-2蛋白的表达有关.

Abstract：

Objective To study the effects of indomethacin on proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma (HCC) cell line MHCC97L with metastatic potential and the effect of indomethacin on the growth and metastasis of HCC. Methods (1) In vitro; Proliferation, Transwell invasion assay, cell motility assay, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) protein activity were evaluated after cells were treated with 0. 2 mmol/L indomethacin. (2)In vivo: Mice bearing xenografts in the liver were randomly divided into control and indomethacin groups. At the end of sixth week, the mice were killed and tumor volume, inhibitory rate, immunohistochemistry assay (IHA) and metastasis were evaluated. Results (1)In vitro; 0. 2 mmol/L indomethacin could inhibit the proliferation of MHCC97L cells markedly (P ＜0. 01). The average amount of invading cells per field in cell invasion assay and motility assay was 2. 2 ± 1. 3 and 4.4 ± 1. 1 respectively in indomethacin group, significantly less than in control group ( 11. 4 ± 1. 9 and 12. 8 ± 1. 8 respectively, P ＜0. 01). The expression of VEGF and MMP-2 in cells treated with indomethacin was significantly lower than in control group (P ＜0. 01). (2)In vivo; Tumor volume, incidence and number of lung metastases in control and indomethacin groups were (1700 ±422) mm3 and (1170 ± 585) mm3 (P ＜ 0. 05), 75% and 50% ( P ＞ 0.05), 2. 92 ± 2. 07 and 1.33 ±1.56 (P＜0. 05) , respectively. Inhibition rate in indomethacin group was 31.2%. IHA showed that the expression of VEGF, MMP-2, and cyclooxygenase-2 ( COX-2) was down-regulated in indomethacin group (P ＜0.01). Conclusion Indomethacin could inhibit the growth and metastasis of HCC, which was in part mediated by down-regulation of VEGF and MMP-2.