烟曲霉感染时NADPH氧化酶通过诱导活性氧活化巨噬细胞自噬

目的研究NADPH氧化酶(NOX)参与烟曲霉孢子诱导巨噬细胞自噬及其作用机制。方法取对数生长期的RAW264.7细胞,随机分为3组:以烟曲霉孢子刺激的处理组、烟曲霉孢子联合NOX抑制剂氯化二亚苯基碘鎓(DPI)的处理组和无处理的空白组。细胞作用2 h后荧光显微镜观察细胞内二氯荧光黄亮度以检测活性氧(ROS)水平,免疫印迹法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达量,免疫荧光技术观察LC3的表达与定位。结果烟曲霉孢子刺激后RAW264.7细胞的ROS与LC3BⅡ表达水平显著升高,同时LC3呈斑点状聚集并与烟曲霉孢子共定位;以DPI抑制后ROS与LC3 BⅡ表达量与空白组相比无明显变化,并且LC3在细胞内弥散分布。结论烟曲霉感染时NOX通过产生ROS活化巨噬细胞自噬。     

pCMV-LC3-Ag85B重组质粒DNA疫苗对结核的免疫保护作用

目的构建结核分枝杆菌Ag85B抗原基因与微管相关蛋白轻链3(LC3)基因融合的DNA疫苗,探究其抗结核分枝杆菌保护效应。方法构建pCMV-LC3-Ag85B重组质粒并转染RAW264.7细胞,Western blot法检测目的蛋白的表达水平。分别以pCMV、pCMV-Ag85B、pCMV-LC3-Ag85B质粒免疫BALB/c小鼠。末次免疫2周后,Ag85B刺激下培养各组小鼠脾脏淋巴细胞,ELISA检测IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10分泌水平。末次免疫3个月后,用H37Rv标准株尾静脉注射感染小鼠,计数肺和脾脏结核分枝杆菌载量。结果 pCMV-LC3-Ag85B在RAW264.7细胞的表达水平与质粒浓度呈剂量依赖性。与pCMV-Ag85B免疫组相比,pCMV-LC3-Ag85B免疫组的IL-2、IFN-γ分泌显著增加,而肺和脾脏内结核分枝杆菌载量降低。结论 pCMV-LC3-Ag85B可显著增强Th1型免疫应答,并显示较好的抗结核分枝杆菌免疫保护效应。     

自然戒断期成瘾药物依赖者CD4^+CD25^+CD127^(low)调节性T细胞的变化特征及意义北大核心CSCD

目的研究自然戒断期成瘾药物依赖者外周血CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(Treg)及外周血单个核细胞(PBMC)中转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA表达水平的变化,探讨成瘾药物对成瘾药物依赖者体内Treg的影响。方法采集自然戒断6个月和18个月半的成瘾药物依赖者各40例及30例健康人的外周血,使用流式细胞仪检测Treg,用RT-PCR检测PBMC中TGF-β1 mRNA表达水平。结果与对照组比较,戒断18个月组Treg、TGF-β1 mRNA含量显著增高,而戒毒6个月组未发现显著性变化。结论成瘾药物对依赖者Treg的影响是长期性的,其介导的Treg异常,可能是引起成瘾药物依赖者免疫功能紊乱的原因之一。     

T-bet佐剂对Ag85B抗结核DNA疫苗的免疫调节

目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法检测质粒蛋白表达情况。3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法检测血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将脾脏淋巴细胞悬液于Ag85B刺激下培养,ELISA法检测培养液中细胞因子分泌情况。结果:质粒蛋白成功表达,并且质粒剂量与质粒蛋白表达水平呈正相关。此外,T-bet/Ag85B不仅诱导IgG2a滴度显著增高伴随IgG1显著降低,而且还刺激IL-2/IFN-γ(Th1类)分泌增加伴随IL-4/IL-10(Th2类)减少。结论:T-bet增强抗Ag85B特异性IgG2a抗体反应,并诱导显著的Th1细胞优势免疫。     

多重PCR快速诊断单纯疱疹病毒、真菌及棘阿米巴角膜炎

目的 建立多重PCR体系对单纯疱疹病毒(HSV)、真菌及棘阿米巴性角膜炎同时诊断,并对真菌性角膜炎主要致病真菌进行菌属鉴定.方法 建立两个多重PCR体系,检测HSV Ⅰ型、HSVⅡ型、4株棘阿米巴分离株及9种主要真菌性角膜炎致病真菌,比较该体系对真菌临床菌株、人类基因组及其他血液常见致病微生物的检测效果.结果 根据DNA模板,该体系可扩增出不同特异性条带,能够准确检测HSV和棘阿米巴,并将9种待测真菌分为4个菌属.84株真菌受试菌株中81株的鉴定结果与常规鉴定结果一致.该体系对人类基因组及其他血液常见致病微生物DNA的扩增结果均为阴性.模板最低阳性扩增的浓度均为10 fg.结论 通过两个多重PCR体系可同时诊断HSV、真菌及棘阿米巴性角膜炎,并可将真菌性角膜炎在菌属水平进行鉴定.该方法具有高效、简便、特异、灵敏的特点,具有较好的临床应用前景.     

多重PCR快速鉴定19种致病真菌

摘要:目的：建立快速鉴定致病真菌的多重PCR体系。 方法：选取19种致病真菌的rDNA内部转录间隔区（ITS）序列设计引物,建立两个多重PCR体系,扩增临床与环境分离真菌菌株、人类细胞及9种常见细菌DNA,检测体系的特异性;以浓度梯度的DNA模板检测体系的灵敏度。 结果：对氟康唑天然耐药的克柔念珠菌、光滑念珠菌以及对两性霉素B耐药的土曲霉、镰刀菌、尖端赛多孢、根霉在该体系中可扩增出特异性条带,其他真菌可同时进行种属鉴定。74株被测真菌菌株的鉴定结果与常规鉴定的符合率为95.9%。两个多重PCR体系对人类基因组及9种常见细菌DNA的扩增结果均为阴性;扩增阳性的最低模板浓度均为10 fg/μL。 结论：建立的两个多重PCR体系可对致病真菌进行检测和种属鉴定。     

TAT-Ag85B蛋白疫苗的制备和抗结核分枝杆菌效果评价

目的探讨利用HIV反向转导结构域(TAT-PTD)系统表达的转导性Ag85B蛋白疫苗的抗结核分枝杆菌效应。方法构建p ET28a-Ag85B、p ET28a-TAT-Ag85B质粒,原核表达纯化和鉴定后获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;将BALB/c小鼠随机分为3组:Ag85B组,TAT-Ag85B组,PBS组。重组蛋白经皮下免疫小鼠3次,末次免疫后1周处死部分小鼠,ELISA检测小鼠血清中Ag85B抗体滴度,以及脾细胞分泌的γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)的水平;用流式细胞术检测巨噬细胞经Ag85B、TAT-Ag85B蛋白刺激后表面分子CD80、CD86变化情况;剩余小鼠经尾静脉感染H37Rv结核分枝杆菌,感染后第1、2、4、8周动态监测小鼠肺和脾内结核分枝杆菌载量,并在感染后8周取肺脏进行HE染色,观察肺组织病变情况。结果成功获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;与Ag85B相比,TAT-Ag85B诱导小鼠表达高水平的Ig G和IFN-γ、IL-2,感染小鼠的脾、肺结核分枝杆菌载量明显减少,肺组织病变范围小、结核分枝杆菌数量少。另外,TAT-Ag85B增强巨噬细胞表面分子CD80/CD86的表达。结论 TAT-Ag85B蛋白疫苗增强巨噬细胞的抗原提呈能力,诱导小鼠产生强烈的Th1免疫应答,有一定的抗结核分枝杆菌保护作用。     

Rab7在自噬体和溶酶体融合过程作用的研究进展

自噬体与溶酶体的有效融合是细胞发挥自噬功能对细胞内多余物质进行降解和再利用的关键。自噬体与溶酶体的融合受控于复杂的信号通路网络,涉及多个环节及众多分子的协同作用,并与内吞机制有部分重叠。Ras相关蛋白7(Rab7,小GTP酶家族的成员)可能是自噬体与溶酶体的融合进程中最为重要的分子之一,在指导自噬体成熟、胞内负荷运输及与溶酶体的对接与融合过程中发挥重要调节功能。自噬体与溶酶体的融合障碍可引起先天性及适应性免疫应答异常,导致炎症、肿瘤及胞内微生物感染的加重。因此控制Rab7的活性可能成为治疗这些疾病的潜在靶点。     

LC3-LpqH增强Ag85B抗结核分枝杆菌DNA疫苗的免疫保护作用

目的探讨微管相关蛋白轻链3-脂蛋白前体-LpqH(LC3-LpqH)DNA佐剂对Ag85B抗结核分枝杆菌(MTB)DNA疫苗免疫保护作用的影响。方法分别用纯化的pCMV-Ag85B、pCMV-LpqH/pCMV-Ag85B、pCMV-LC3-LpqH/pCMV-Ag85B、pCMV质粒DNA对BALB/c小鼠进行3次肌肉注射免疫。末次免疫2周后,ELISA检测血清中抗Ag85B IgG亚型及滴度。Ag85B刺激下培养各组小鼠脾脏淋巴细胞,ELISA检测血清白细胞介素2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10分泌水平。末次免疫3个月后,用MTB标准毒株H37Rv尾静脉注射感染小鼠,计数肺和脾脏MTB载量并观察肺组织病理变化。结果与Ag85B免疫组相比,LC3-LpqH/Ag85B免疫组抗Ag85B的IgG2a水平显著提高,而IgG1水平显著降低,并伴随IL-2、IFN-γ分泌增加及IL-4、IL-10减少,肺和脾脏内MTB载量降低,肺组织病变程度减轻。结论 LC3-LpqH可显著增强Ag85B抗MTB疫苗的Th1型免疫应答,并显示较好的免疫保护效应。