案例教学在早期基础医学教育中的问题与对策

案例教学法近年来被广泛应用于医学院校的教育教学改革。基础医学课程是临床医学专业重要的基石。以细胞生物学课程为核心整合多个学科设计案例,在南京医科大学临床专业低年级学生中初步尝试了案例教学法。文章调研了低年级学生在案例学习时遇到的障碍和问题,总结了针对低年级学生的案例课程在编排上的特征,提出教师在教育教学改革中面临的新的机遇与挑战,希望这些实践经验为医学及相关专业开展教育教学改革提供宝贵的经验。     

基础医学专业《Cell Counting Kit-8法测定贴壁细胞数》实验课程设计

《细胞生物学研究方法与实验技术》是首都医科大学面向基础医学专业本科生开设的一门理论与实验相结合的课程,《Cell Counting Kit-8法测定贴壁细胞数》是其中的实验课程之一.在本次实验中,针对肝癌细胞系BEL-7402设计不同接种密度、CCK-8孵育浓度和作用时间,通过酶标分析仪检测450 nm处吸光度,然后以细胞密度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制BEL-7402细胞的生长曲线从而明确细胞的增殖情况.笔者在多年的教学实践中通过不断尝试和探索,对本次实验的课程设计,包括实验基本原理、教学目标、实验内容和教学程序等做出归纳和总结,旨在为相关教育工作者的教学实践提供参考.     

NNMT基因启动子双荧光素酶报告系统的构建及其与SND1靶向关系的验证

目的:构建尼克酰胺-N-甲基转移酶（NNMT）启动子区的双荧光素酶报告质粒并检测其活性,从而验证SND1蛋白对NNMT基因的调控作用。方法:根据NNMT基因启动子区上、下游-1 500至+200区间的序列设计引物,并以HepG2细胞提取的RNA逆转录得到cDNA为模板进行PCR扩增,得到的NNMT启动子区片段经酶切后连接到双荧光素报告载体GLuc-ONTM启动子报告克隆中,得到Gluc-NNMT 启动子重组质粒,分别与pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1质粒和pLVX-IRES-Puro-vector质粒共同转染HeLa细胞,并检测启动子活性。然后用免疫共沉淀的方法验证NNMT蛋白是否与SND1蛋白之间存在相互作用。结果:重组质粒构建成功。双荧光素酶活性实验显示,共转染Gluc-NNMT启动子重组质粒和pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1过表达质粒的实验组与对照组相比,NNMT启动子区活性明显增强。结合免疫共沉淀实验结果,证明NNMT与SND1存在相互作用。结论:成功构建了NNMT启动子双荧光素酶报告质粒,SND1对NNMT启动子活性有增强作用,SND1与NNMT蛋白之间存在相互作用。     

血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源神经干细胞增殖的促进

目的:观察血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源的神经干细胞增殖的促进作用,为临床治疗提供实验依据。方法:实验于2003-10/2005-05在北京大学医学部干细胞研究中心完成。小鼠胚胎干细胞在不含有白细胞抑制因子的条件下形成类胚体,经过7d选择性培养得到神经干细胞,利用免疫荧光的方法检测神经干细胞标志物nestin以及sox-2的表达情况;将神经干细胞与血管内皮生长因子共培养,通过氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入的方法测定细胞的增殖速度;在外源性血管内皮生长因子存在的情况下,利用受体2中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体,观察外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结果:经鉴定胚胎干细胞来源的神经干细胞(95±3)%以上表达神经干细胞标志物nestin以及sox-2,该细胞在体外可以传代。与血管内皮生长因子共培养后,发现随着血管内皮生长因子浓度的升高神经干细胞增殖速度明显加快。通过中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体2可以阻断外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结论:实验中诱导小鼠胚胎干细胞得到了高纯度的神经干细胞,血管内皮生长因子能够通过血管内皮生长因子受体2促进神经干细胞增殖。     

ATRA诱导小鼠间充质干细胞棕色成脂分化的分子机制

目的研究全反式维甲酸(ATRA)或骨形态发生蛋白7(BMP7)诱导小鼠间充质干细胞定向分化为成熟棕色脂肪细胞的作用及机制。方法采用ATRA或BMP7对小鼠间充质干细胞C3H10T1/2进行体外诱导,使其向棕色脂肪细胞定向分化,比较二者诱导分化棕色成脂效果;采用油红O染色鉴定棕色脂肪细胞成脂能力,线粒体染色检测棕色脂肪细胞富集的线粒体,免疫印迹法检测脂肪分化相关基因、棕色脂肪标志基因表达,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测BMP7、线粒体相关基因及棕色脂肪细胞分化抑制因子Necdin、Wnt10a及Pref1的表达情况。结果 ATRA诱导C3H10T1/2细胞向棕色脂肪细胞分化的最适浓度为1～2μmol/L。采用1μmol/L ATRA预处理3 d(ATAR组)后,与对照组[采用二甲基亚砜(DMSO)处理]比较,ATRA组线粒体相关基因CyctoC、Tfam及Nrf1的mRNA相对表达量明显升高(P0.05),棕色脂肪细胞分化抑制因子Necdin和其下游靶基因Pref1、Wnt10a的mRNA相对表达量明显降低(P0.05),BMP7 mRNA相对表达量明显升高(P0.05)。不同浓度的ATRA均可使BMP7蛋白表达量升高,且呈剂量效应。采用1μmol/L ATRA预处理0、24和48 h,BMP7蛋白表达量逐渐升高,Necdin蛋白表达量逐渐降低。ATRA与BMP7的诱导效果一致。结论 ATRA具有诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2分化为棕色脂肪细胞的能力,其机制可能是通过调控BMP7,诱导棕色前体脂肪细胞定向分化。     

鼠原始生殖细胞报告基因系统的建立及验证

目的:构建小鼠原始生殖细胞（PGCs）报告基因系统。方法:根据CRISPR基因编辑技术结合同源重组原理,针对鼠Prdm1和Dppa3基因的翻译起始位点ATG附近位置分别设计一对sgRNA,并根据Cas9切割位点以及拟插入目的片段构建相应的用于同源重组的供体质粒,将sgRNA与Donor质粒同时转染入小鼠胚胎干细胞（ESCs）中,并利用质粒携带的抗性基因筛选出目标单克隆细胞,并进行基因型鉴定。结果:通过提取单克隆细胞的基因组DNA进行基因型鉴定,PCR和Sanger测序结果显示,单克隆细胞的基因组中,Prdm1和Dppa3基因翻译起始位点后分别成功插入eGFP和mCherry荧光蛋白编码序列。利用细胞因子诱导eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3mESCs（mouse ESCs）定向分化为mPGCs（mouse PGCs）,流式细胞仪检测显示诱导分化的mPGCs特异表达eGFP和mCherry荧光信号。结论:成功构建mPGCs报告基因系统,可用于后续研究mPGCs命运决定的分子机制,对于研究小鼠早期胚胎发育过程具有重要意义。     

S1PR1/3介导骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的信号通路探讨

目的在转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)诱导的分化模型中探讨RhoA信号对于磷酸鞘氨醇受体1/3(sphingosine 1-phosphate receptor 1/3,S1PR1/3)介导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)向肌成纤维细胞(myofibroblast,MF)分化的影响及其机制。方法分离并培养小鼠原代BMSC,TGFβ1诱导其分化。采用qRT-PCR检测分化标志物平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,αSMA)、Ⅰ型胶原[procollagenα1(Ⅰ),Colα1(Ⅰ)]和Ⅲ型胶原[Colα1(Ⅲ)]的mRNA表达;采用Pull-down试剂盒检测RhoA的活化。结果 TGFβ1能够显著上调BMSC细胞中分化标志物αSMA、Colα1(Ⅰ)和Colα1(Ⅲ)的mRNA表达,呈现剂量依赖效应。TGFβ1能够激活小G蛋白RhoA,该作用可以被S1PR1或S1PR3拮抗剂所阻断。RhoA抑制剂C3转移酶能够阻断TGFβ1诱导的αSMA、Colα1(Ⅰ)和Colα1(Ⅲ)mRNA水平的上调。结论RhoA信号参与了S1PR1/3介导的BMSC向MF的分化。     

卵巢颗粒细胞中胰岛素和雄激素对芳香化酶和5α-还原酶1影响的研究

目的研究卵巢颗粒细胞中胰岛素对睾酮激素转化过程的影响。方法选用人卵巢颗粒细胞瘤样细胞系(KGN)作为研究对象。应用RT-PCR分析KGN细胞在梯度睾酮(1.25、2.5、5、10、20ng/ml)及胰岛素(1、10、100ng/ml)处理4h后CYP19a1和5RD5A1mRNA水平;Western-blot检测高浓度睾酮(10、20ng/ml)及梯度胰岛素处理KGN细胞24h后芳香化酶和5α-还原酶1蛋白水平;同步收集上清,应用放射性免疫法及酶联免疫法检测培养液上清睾酮、雌二醇及双氢睾酮的浓度。结果胰岛素剂量依赖性地上调CYP19a1的表达和活性,增加睾酮向雌二醇的转化;同时抑制5RD5A1的表达和活性,抑制睾酮向双氢睾酮的转化;转化比例改变但消耗水平不变,导致睾酮的异常累积。结论高雄激素环境下,胰岛素可通过影响睾酮转化酶促使睾酮转化异常。本实验为高胰岛素及高雄激素水平在卵巢微环境相互作用加剧PCOS病程提出了可能的机制。     

实体瘤CAR-T治疗的挑战与展望

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)治疗是通过体外改造T细胞,使其能特异性识别和杀伤肿瘤细胞,从而达到肿瘤治疗目的的一种新技术。目前,CAR-T治疗相关的临床试验正在全世界范围内广泛开展,CD19靶点的CAR-T在治疗血液肿瘤方面取得了革命性的成功,CAR-T疗法正成为继手术、放疗、化疗之后的又一新的肿瘤治疗方法。然而,对于癌症中的主要类型实体瘤,目前CAR-T治疗的研究依然缺乏实质性进展。本文以实体肿瘤的CAR-T治疗为切入点,简要概述了实体肿瘤相较于血液肿瘤的特征和治疗难点,以及目前CAR-T治疗实体瘤面临的主要挑战及展望。     

自噬-溶酶体途径调控核仁小核糖核蛋白 RRP9 的蛋白质降解

目的 研究核仁小核糖核蛋白 RRP9 的蛋白降解机制。 方法 组织表达谱分析 RRP9 在小鼠和人 类正常组织中的种属特异性和在不同组织中的特异性表达, 并分析 RRP9 在人的正常结直肠组织和结直肠 癌组织中的表达差异; 使用放线菌酮 (cycloheximide, CHX) 抑制结直肠癌细胞蛋白合成来检测 RRP9 蛋白 半衰期; 抑制自噬-溶酶体途径后检测 RRP9 蛋白含量变化以明确自噬-溶酶体途径对 RRP9 蛋白水平的影 响; 最后通过免疫荧光和免疫共沉淀检测 LC3b 与 RRP9 之间的相互作用。 结果 RRP9 为长寿命蛋白; 抑 制自噬-溶酶体途径使 RRP9 蛋白水平升高; RRP9 与 LC3b 之间存在相互作用。 结论 自噬-溶酶体途径调 控 RRP9 蛋白的降解。