脂肪干细胞及血管内皮细胞提高游离脂肪移植成活的实验研究

目的探讨脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)及血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)对脂肪移植术后血管新生及脂肪成活的影响。方法取乳房切除术患者自愿捐赠的脂肪组织,采用胶原酶消化法分离培养ADSCs,取第3代细胞进行实验;同时制备游离脂肪颗粒。取健康4~6周龄雄性裸鼠80只,随机分为4组(n=20),分别于裸鼠背部皮下注射1 m L脂肪颗粒+0.3 m L生理盐水(对照组)、1 m L脂肪颗粒+2×106个人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)+0.3 m L生理盐水(ECs组)、1 m L脂肪颗粒+2×10!6个ADSCs+0.3 m L生理盐水(ADSCs组)、1 m L脂肪颗粒+1×10~6个HUVECs+1×10!6个ADSCs+0.3 m L生理盐水(ADSCs+ECs组)。注射后观察各组裸鼠存活情况,大体观察背部移植区色泽、形状。2、4、8、12周时背部移植区行超声影像学观察,取标本采用排水法测量其体积,组织学观察移植脂肪大体结构变化情况,免疫荧光染色观察血管新生情况。结果各组裸鼠均存活至实验完成。移植后各时间点各组超声检测结果无明显差异,移植脂肪内部均未见明显血流信号,未见囊肿、钙化、实性占位等异常表现。移植后各时间点,ADSCs组及ADSCs+ECs组移植脂肪体积均高于ECs组及对照组(P0.05);且8、12周时ADSCs组明显高于ADSCs+ECs组(P0.05)。HE染色示移植后各组组织学形态变化趋势相似,但ADSCs组组织重塑速度快于其他各组。免疫荧光染色示随时间延长各组新生血管逐渐增加,各时间点ECs组、ADSCs组、ADSCs+ECs组微血管密度均高于对照组(P0.05);4周时ADSCs组微血管密度高于ECs组及ADSCs+ECs组(P0.05);8、12周时ADSCs组及ADSCs+ECs组高于ECs组(P0.05),ADSCs组及ADSCs+ECs组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 ADSCs可提高移植脂肪存活率,且该促进作用可能与促进血管新生相关。     

大鼠成骨细胞增殖及护骨素蛋白含量与甲状旁腺激素的调节效应

目的:体外观察甲状旁腺激素对大鼠成骨细胞增殖和护骨素分泌的调节作用。方法:实验于2005-06/2006-05在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成。采用酶消化法和骨组织块法联合分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞,间歇加药方法将不同浓度0,10-6,10-7,10-8,10-9mol/L甲状旁腺激素作用于大鼠成骨细胞(0mol/L作为空白对照组),经碱性磷酸酶染色及钙结节茜素红染色证实培养的成骨细胞后,采用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞增殖能力,蛋白免疫印迹测定护骨素的分泌量。结果:①成骨细胞的形态变化:倒置相差显微镜下可见培养的成骨细胞呈短梭形、三角形和多边形。碱性磷酸酶染色光镜下可见成骨细胞胞浆中分布特征性蓝紫色细颗粒;成骨细胞的钙结节在镜下可见部分细胞聚集一起呈"集落状"生长。②成骨细胞增殖率:10-6～10-9mol/L浓度甲状旁腺激素对成骨细胞增殖均显示刺激作用,与空白对照组相比,差异显著(P<0.05),增殖率以10-8mol/L甲状旁腺激素组最高。③成骨细胞护骨素的表达:甲状旁腺激素下调成骨细胞中护骨素的分泌,与空白对照组相比,10-6mol/L甲状旁腺激素组抑制作用最明显(P<0.01),无显著剂量依赖性。结论:甲状旁腺激素对体外培养成骨细胞的增殖具有明显促进作用,通过下调成骨细胞中护骨素的分泌,促进破骨细胞生成、活化,促进骨吸收。     

一氧化氮外源性供体L-arginine对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的:一氧化氮在维持机体多个系统的生理功能中起重要作用,许多慢性疾病可造成一氧化氮产生减少,此时一氧化氮供体是一种必要的补充。观察一氧化氮外源性供体L-arginine对体外培养破骨细胞增殖及骨吸收功能的影响。方法:实验于2005-06/2006-05在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成。选择出生1d的清洁级SD大鼠乳鼠,采用骨髓诱导法体外培养破骨细胞,培养液内分别加入0.3,0.6,1.0g/L不同浓度的L-arginine,并以等体积三蒸水作为对照。培养7d后,以抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞数目、形态,MIAS-2000图像分析仪检测骨片上骨吸收陷窝的数目和面积,并用扫描电镜观察不同浓度L-arginine对骨吸收陷窝的影响。结果:①破骨细胞的一般形态:破骨细胞较其他细胞大,形态不规则,呈油煎蛋形、长条形、腊肠形或漏斗形等,细胞内可见几个至几十个核不等。抗酒石酸酸性磷酸酶染色酶活性部分酒红色,颗粒状。②抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数:各组破骨细胞数目随着L-arginine浓度增加而减少(P<0.05)。③骨吸收陷窝的面积和数目:骨片培养7d,吸收陷窝计数的结果显示,0.3g/L以上浓度L-arginine对破骨细胞吸收功能均有明显抑制作用,并呈剂量相关性。0.3g/LL-arginine组陷窝面积为对照组的91%(P<0.05),0.6g/LL-arginine组为对照组的80%(P<0.05),1.0g/LL-arginine组为对照组的69%(P<0.01)。结论:采用骨髓诱导法培养的破骨细胞数量多、纯度高,且具有明显的骨吸收功能。L-arginine抑制破骨细胞增殖,抑制破骨细胞骨吸收功能,并呈剂量相关性。     

骨骼肌无细胞基质的制备及其生物相容性研究

目的细胞外基质是脂肪组织工程材料的研究热点之一。通过探讨骨骼肌无细胞基质的制作方法及生物相容性,为其在脂肪组织工程中的应用奠定基础。方法取健康成年小香猪新鲜骨骼肌组织,横切成厚2～3 mm的组织块,采用低渗-去垢剂法脱细胞处理。处理后采用HE染色、Masson三色染色、免疫组织化学染色及扫描电镜检测骨骼肌无细胞基质是否有细胞成分残留,并观察其基本结构;应用MTT法检测骨骼肌无细胞基质细胞毒性。取乳腺癌患者自愿捐赠脂肪组织,分离培养人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs),从形态学、流式细胞学和成脂、成骨分化能力方面进行鉴定。将骨骼肌无细胞基质与第3代hADSCs共培养,于培养后第1、3、5、7天通过细胞活性检测材料上细胞黏附、扩散和增殖情况,了解其与细胞之间的相互作用。结果 HE、Masson、免疫组织化学染色及扫描电镜观察显示骨骼肌无细胞基质肌纤维去除完全,无细胞核残留,基质结构保留完整;大量连接成网状的胶原纤维呈多孔隙样结构,规则排列。MTT检测示骨骼肌无细胞基质细胞毒性为1级,细胞相容性好。细胞活性检测示hADSCs在骨骼肌无细胞基质上能很好地伸展,且能与周围基质黏附,进入基质内部并相互交织。结论经脱细胞处理的骨骼肌无细胞基质具有良好生物相容性,可能作为脂肪组织工程的支架材料。     

音猬因子调控BMSCs表达和分泌VEGF及bFGF的实验研究

目的音猬因子(Sonic hedgehog,Shh)介导的信号参与调控血管生成的重要环节。研究不同浓度的重组Shh-N(recombinant Shh N-termitant,rShh-N)对BMSCs表达和分泌VEGF和bFGF的影响。方法取健康3日龄SD大鼠骨髓分离培养BMSCs,体外扩增至第3代,分别用含0、10、100、200 ng/mL rShh-N的L-DMEM培养BMSCs,作为A、B、C、D组。培养12、24、48、72 h后行ELISA法检测各组上清液中VEGF和bFGF的浓度,实时荧光定量PCR法检测各组VEGF和bFGF mRNA的表达水平。结果在基因表达水平上,D组各时间点的VEGF和bFGF mRNA表达量均明显高于A组(P<0.05),且在12、48 h表达量高于24、72 h(P<0.01);C组在各时间点均促进bFGF mRNA表达(P<0.05),在24～72 h促进VEGF mRNA表达(P<0.05),且在72 h时表达量均最高(P<0.01);B组在12 h抑制VEGF mRNA表达(P<0.05),48 h和72 h表现出促进作用(P<0.05),在12～48 h明显促进bFGF mRNA表达(P<0.05),且在48 h时的表达量最高(P<0.01)。在蛋白水平上,D组各时间点VEGF和bFGF分泌量均高于A组(P<0.01);C组在24～72 h VEGF和bFGF分泌量明显多于A组(P<0.05);B组在12 h和48 h抑制VEGF的分泌(P<0.05),24 h增加其分泌作用(P<0.05),而在24 h和48 h促进bFGF的分泌(P<0.05)。各组在48 h和72 h时的VEGF和bFGF分泌量明显多于12 h和24 h(P<0.05)。结论 rShh-N可促进BMSCs表达和分泌VEGF和bFGF,为进一步探讨rShh-N和MSCs联合应用于治疗缺血性相关疾病以及促进骨修复重建的可行性提供了实验依据。     

以脱细胞牛软骨基质为支架体外构建组织工程软骨的实验研究

目的以脱细胞牛软骨基质（acellular cartilaginous matrix,ACM）作支架体外构建组织工程软骨,了解其作为软骨组织工程支架的可行性。方法 2003年1月-2005年12月联合应用冻干-反复冻融-酶消化法对牛软骨基质行脱细胞处理。将体外培养扩增的2～5代兔软骨细胞接种在材料上,体外培养3周,观察软骨细胞在支架材料上的生长分布情况。结果软骨细胞在制备的ACM上可较好地黏附生长,并且分泌大量Ⅱ型胶原和葡萄糖胺聚糖;但软骨细胞不能长入ACM内部,只能在表层生长,少量软骨细胞分布在ACM孔隙中。结论 ACM支架材料具有良好的细胞相容性和活性,并且能促进软骨细胞增殖和维持软骨细胞表型。     

8%乳化异氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用

目的探讨乳化异氟醚(ISO)对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用。方法60只♂SD大鼠,随机分为6组。假手术组仅分离血管,不留置线拴;脑缺血模型(MO)组缺血前吸入纯氧30 min后行大脑中动脉阻闭(MCAO),2 h后抽出线栓恢复再灌注;吸入ISO组缺血前吸入0.9%ISO 30 min;乳化ISO组缺血前给予17 ml.kg?.1h?18%乳化ISO;异丙酚(PRO)组缺血前给予15 mg.kg?1PRO;30%脂肪乳(INT)组缺血前给予30%INT17 ml.kg?.1h?1,各组于再灌注后24 h进行神经功能评分(DNS)并计算24 h时脑梗死体积。结果术后,乳化ISO组、吸入ISO组和PRO组的DNS评分明显低于MO组(P<0.05);再灌注24 h后MO组的脑梗死体积为227.5±18.15 mm3,乳化ISO组、吸入ISO组的梗死面积缩小(P<0.05),但乳化ISO组和吸入ISO组的梗死面积无显著性差异。结论缺血前给予乳化ISO,对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤可起一定的保护作用。     

脊索细胞促进髓核软骨样细胞增殖及表型维持

目的分离纯化兔髓核中的细胞成分，观察脊索细胞形态及对软骨样细胞增殖及细胞表型的影响。方法6只4周龄新西兰兔胸腰段脊柱，获取髓核，0．2％Ⅱ型胶原酶消化法及不连续密度梯度法分离纯化脊索细胞及软骨样细胞。实验分为单纯软骨样细胞培养组（A组）及脊索细胞、软骨样细胞（1：1）共培养组（B组）。倒置相差显微镜观察两组细胞生长情况，测定两组原代及传代细胞成活率，MTT法测定两组第2代细胞增殖曲线，并以甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色鉴定两组原代及传代细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原的表达。结果成功分离、纯化脊索细胞和软骨样细胞。细胞培养观察，原代脊索细胞直径10～15gm，胞浆内富含大小不等的囊泡；原代软骨样细胞直径4～6gm，胞浆内无囊泡。各代细胞成活率A组为89．0％～95．3％，B组为91_3％～96．3％，各代细胞成活率两组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。A组细胞培养3～4d进入对数生长期，B组细胞培养2d后进入对数生长期；培养4d后，B组细胞增殖能力高于A组，差异有统计学意义（P〈0．05）。A组3代以内细胞表达蛋白多糖及Ⅱ型胶原，B组细胞表型维持至5代。结论脊索细胞能促进髓核软骨样细胞的增殖及表型维持；脊索细胞可能在防止椎间盘退变中具有重要意义。     

成骨细胞条件培养液对BMSCs诱导分化作用研究

目的 探讨大鼠成骨细胞条件培养液对同种大鼠BMSCs的成骨诱导分化作用,为骨组织工程种子细胞的获得寻找一种新方法 . 方法 健康1周龄SD大鼠10只,雌雄不限,体重20～30 g,采用贴壁法和酶消化法分别获得BMSCs和成骨细胞,并进行鉴定.无菌条件收集第1～5代成骨细胞培养液上清,与完全培养基1:1混合,制备成骨细胞条件培养液,与第2代BMSCs共培养为诱导组,相同代次BMSCs与完全培养液共培养为对照组.倒置相差显微镜下观察共培养后BMSCs形态变化,MTT法检测BMSCs生长情况,免疫组织化学染色检测共培养后BMSCs的ALP、Col Ⅰ、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白的表达,采用RT-PCR检测Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导组共培养7 d BMSCs体积变大,细胞由长梭形展开为扁平形和多边形,并带有突起;9 d细胞呈集落状生长.细胞生长曲线示BMSCs数量随培养时间延长而增加,对照组增殖能力较诱导组强;诱导培养4～7 d,对照组细胞数量与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05).诱导组培养12 d,ALP染色呈阳性表达;18 d 出现钙结节;21 d Col Ⅰ和OCN呈阳性表达;对照组均呈阴性表达.RT-PCR检测示诱导组培养21 d有Col Ⅰ、OCN mRNA表达,对照组未见表达. 结论 体外大鼠成骨细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠BMSCs向成骨样细胞分化的作用.     

上皮细胞条件培养液对BMSCs分化的影响

目的 探讨上皮细胞条件培养液(epithelial cell conditioned medium,ECCM)体外诱导犬BMSCs向上皮细胞分化的可行性.方法 成年健康雄性比格犬1只,体重10 kg.于犬髂后上棘采用骨髓穿刺法取骨髓5 mL,分离培养BMSCs.取犬口腔黏膜下组织,剪成约4 mm×4 mm大小,制备ECCM.取第2代BMSCs以2×104个/孔细胞密度接种,实验组于ECCM中培养,对照组于低糖DMEM完全培养基中培养.观察两组细胞形态特征,MTT法绘制生长曲线,诱导培养21 d免疫组织化学染色鉴定上皮细胞特异性标志物--细胞角蛋白19(cytokeratinl9,CK-19)和细胞角蛋白AE1/AE3,透射电镜观察细胞超微结构.结果 倒置相差显微镜下见两组细胞均呈长梭形,均匀分布,折光性较强,增殖迅速.两组细胞生长曲线均呈"S"形,实验组生长曲线较对照组右移,提示ECCM对细胞增殖有抑制作用.实验组CK-19和细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学染色均呈阳性反应,对照组呈阴性.透射电镜下实验组细胞胞浆内可见紧密连接.结论 ECCM体外有诱导同种BMSCs向上皮细胞分化的作用.