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1.
目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物?通过克隆?表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性?方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XSS-GP73,诱导表达,以HisFF Trap亲和层析柱纯化GP73-6×His重组融合蛋白?以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗GP73单克隆抗体?以间接法ELISA检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测肝癌患者血清中GP73表达水平?结果:成功表达并纯化了GP73-6×His重组蛋白;获得5株稳定分泌抗人GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株;免疫共沉淀证实抗GP73 单克隆抗体能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合,GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高?结论:成功制备了抗人GP73单克隆抗体,为后期建立检测人GP73的双抗体夹心ELISA方法打下基础? 相似文献
2.
目的构建人源Fab噬菌体抗体库,筛选抗hPRLR抗体片段并进行初步鉴定。方法从乳腺癌患者外周血提取总RNA,通过RT-PCR扩增人抗体轻链和重链基因,构建抗hPRLR人源Fab抗体库。分别以His-hPRLR融合蛋白、BSA-hPRLR表位多肽融合蛋白和GST-hPRLR融合蛋白作为抗原包板,经过3轮循环的吸附-洗脱-扩增的筛选及1轮交叉筛选,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,将筛选到的阳性克隆FabG2转化至Top10’受体菌,诱导表达可溶性Fab抗体,通过Western blot和ELISA进行特异性的鉴定。结果构建的人源Fab库容为1.0×109,4轮的筛选,获得6株能与hPRLR结合的人源抗体克隆。选取的FabG2能够进行可溶性Fab抗体蛋白的表达,ELISA初步鉴定,能够与hPRLR进行特异性地结合。结论成功构建了人源Fab噬菌体抗体库,筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆。hPRLR特异性Fab抗体的获得将为高表达hPRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。 相似文献
3.
目的构建和表达日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体,初步鉴定表达产物的活性。方法用overlap PCR法扩增双链抗体基因VH-GGGGS—VL将双链抗体基因重组入原核表达载体pBAD/gⅢ。表达质粒转化E.coli TOP10F’,左旋阿拉伯糖诱导表达。对表达产物进行分离纯化,ELISA检测纯化蛋白与血吸虫病人血清抗体的结合活性。结果测序证实双链抗体基因正确,构建了双链抗体的原核表达系统,双链抗体在细菌超声上清和沉淀内均有表达,分子量约为34kD。纯化产物经ELISA鉴定,结果表明NP30单特异性双链抗体可与血吸虫病人血清抗体特异性结合。结论构建和表达的日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体具有与亲本单抗相同的结合活性。 相似文献
4.
目的:对比研究兔多抗C-28和鼠单抗MET4在胰腺癌组织中检测MET蛋白表达的差异性和相关性。方法:采用免疫组化间接法研究C-28和MET4检测67例胰腺癌组织中MET表达情况,定量图像分析MET4和C-28的检测效能。结果:MET4和C-28检测胰腺癌的阳性率分别为70.1%和71.6%。两种抗体检测MET阳性率无显著差异(χ2=0.980,P=0.387)。相关分析显示两者无显著相关性(r=-0.127,P=0.307),在C-28未检出的病例中有84.2%(16/19)MET4检出,在MET4未检出的病例中有85.0%(17/20)C-28检出。在无MET蛋白表达的胰岛和正常胰腺上皮中,C-28有染色,而MET4无染色。结论:相对C-28抗体,MET4用于检测胰腺癌MET蛋白表达具有较高的特异性。 相似文献
5.
目的:检测鼻息肉患者血清抗Epstain-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)抗体并探讨其临床意义。方法:行功能性鼻内镜手术治疗的鼻息肉患者20例为实验组,健康自愿者20例为对照组。以谷胱甘肽-EBV-LMP1胞外区融合蛋白(GST-LMP1)为检测抗原,ELISA和Western blot检测健康自愿者和鼻息肉患者手术治疗前、治疗后第15、30、90、180天血清抗EBV-LMP1抗体。结果:ELISA检测鼻息肉患者和健康自愿者血清抗EBV-LMP1抗体水平分别为0.976±0.131、0.400±0.102,两组比较有统计学差异(P<0.01)。鼻息肉患者术前和术后第15、30、90、180天血清抗EBV-LMP1抗体水平分别为:0.976±0.131、0.921±0.138、0.899±0.168、0.576±0.144、0.521±0.117,术后第90、180天与术前比较,差异有统计学意义(P<0.01);但是术后第15、30天与术前比较,无统计学差异。Western blot检测鼻息肉患者术前血清抗体水平与术后第15、30天比较无统计学差异;但是与术后第90、180天比较有统计学差异(P... 相似文献
6.
目前用于脑出血治疗研究的主要细胞有:神经干细胞、遗传工程神经干细胞、骨髓间质干细胞、脐血细胞、胚胎干细胞、重组细胞、微囊化人工细胞等,本文就前5种细胞移植在出血性脑损伤中的保护作用进行综述。干细胞移植在脑出血性动物身上的实验所取得的良好效果,显示细胞移植重建损伤的脑组织、改善脑功能成为治疗脑出血疾病的必然途径。临床实验也取得了一定效果,但要真正应用于临床目前还有许多问题要解决:要想准确的定向诱导细胞分化,需要更深入的研究局部微环境,细胞因子及基因对干细胞分化的作用;细胞移植促进脑出血功能的恢复,其确切的机制还需要进一步研究 ;诱导分化的神经干细胞是否能象正常神经细胞一样能分泌神经递质,是否具有复杂的电生理等。 相似文献
7.
背景:细胞分化、细胞融合乃至克隆均需要应用分离细胞核的方法以获得大量有活性的细胞核,但是目前很难在数量和质量上同时达到较高的水准。
目的:探索简单易行的分离细胞核的方法,为神经元细胞核移植、细胞拆合以及细胞核成分的研究提供大量完好有活性的细胞核。
设计、时间及地点:对比实验,于2006-09/2007-01在南京医科大学基础医学院卫生部抗体技术重点实验室完成。
材料:Cytochalasin B为Sigma公司提供,清洁级SD孕大鼠来源于南京医科大学动物实验中心。
方法:取胎鼠大脑皮质,进行神经元的培养并鉴定。用Cytochalasin B结合梯度离心法及细胞核分离液法两种方法进行细胞核分离的对比观察。
主要观察指标:用碘化丙啶标记后进行流式细胞仪检测凋亡率并用免疫荧光染色对细胞核进行形态学观察。
结果:两种方法均成功地分离出大量有活性神经元细胞核,且梯度离心法可以得到较为完整的胞质体,与完整细胞细胞核荧光强度比较无显著性差异(P〉0.05)。
结论:Cytochalasin B结合梯度离心法及细胞核分离液法均能够有效地进行神经元细胞核的分离,且细胞核在短期内有较高的活性。 相似文献
8.
目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgG Fc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性.方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc.所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价.结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60 ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合.结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备. 相似文献
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日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究 总被引:2,自引:1,他引:1
目的 探讨日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用以增强免疫保护作用的效果。方法分别大量制备质粒DNA:pcDNA3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6和重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30。pcDNA3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6等量混合后即为鸡尾酒式的混合DNA疫苗,重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30等量混合后即为鸡尾酒式的混合蛋白疫苗。70只BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D、E5组,每组14只。A组为自然感染组;B组(空质粒对照组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3.1;C组(空质粒+混合蛋白对照组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3.1,第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗+100μl福氏完全佐剂(FCA);D组(混合DNA组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗;E组(混合DNA+混合蛋白组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗,第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗+100μlFCA。DNA免疫组末次免疫后4周,蛋白加强组末次免疫后2周,所有小鼠同时经腹部皮肤感染(40±1)条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠,计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血,分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a,并取小鼠脾脏制备单个脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果C、D组和E组的减虫率分别为17.70%、32.88%和45.35%,D组和E组的减虫率均显著高于C组(P均〈0.01),且E组的减虫率显著高于D组(P〈0.01);C、D组和E组的减卵率分别为9.39%、36.20%和48.54%,D组和E组的减卵率均显著高于C组(P均〈0.01),且E组的减虫率也显著高于D组(P〈0.05)。C、D、E3组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,? 相似文献
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目的 克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shiga toxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能.方法 从EHECO157:H7基因组中克隆编码Stx Ⅱ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切后,导入表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌Topl0F',经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-A和GST-B融合蛋白.分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得高免血清,观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 Stx Ⅱ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化;A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击.结论 Stx Ⅱ型A、B亚单位蛋白可以作为EHEC O157:H7疫苗的候选分子,同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用. 相似文献