融水小型猪的实验动物化系列研究概述

融水小型猪的种源来自广西融水县,2012年被引到广东繁育并测定了基础数据,包括种质特性、繁殖性能、生长曲线、血液学指标、血生化指标、脏器系数、染色体分析。参照国家和地方有关实验动物标准,初步建立了融水小型猪微生物与寄生虫、环境与设施、饲料、病理学、遗传学等质量控制标准。融水小型猪能适应当地气候,繁殖良好,自然受孕率为88.3%,妊娠期平均112 d,初产平均胎产仔6.1头,经产平均产仔7.9头。融水小型猪体型小,雌雄成年体重(6月龄)分别为17.21±5.20 kg和16.35±5.23 kg,性情温顺,线粒体DNA分析表明融水小型猪比兰屿猪更为古老。通过标准化的饲养管理与质量控制,具有培育成实验用小型猪的基本条件。     

pitx2基因早期过量表达对斑马鱼牙齿生长发育相关基因的影响

目的:研究pitx2基因早期过量表达对斑马鱼牙齿发育相关基因的影响。方法:利用RT-PCR技术克隆pitx2特异性基因片段;插入特异性酶切位点后以之为模板体外合成pitx2 mRNA。选取正常交配获得的斑马鱼胚胎,随机分为4组采用显微注射技术构建pitx2过表达模型:实验1组注射pitx2 mRNA200 pg/nL;实验2组注射pitx2 mRNA 100 pg/nL;实验3组注射YFP mRNA 100 pg/nL作为对照;实验4组为不注射任何基因作为野生型。分别于注射后24、48、72 h观察胚胎发育情况;利用RT-PCR检测5个与斑马鱼牙齿发育相关基因的表达情况。结果:成功克隆含有pitx2基因CDS的片段并体外合成mRNA。显微镜下观察发现:pitx2早期过量表达可造成胚胎发育停止、心包水肿、脊索变形和眼部发育畸形等形态学改变。相关基因检测显示,与对照组和野生型组相比,注射100 pg/nL pitx2 mRNA组bmp4表达明显下调(P<0.05);fgf8、lef1、runx2a表达均明显上调(P<0.05);dlx2b表达各组之间未见明显差异(P<0.05)。结论:pitx2早期过量表达对斑马鱼牙齿发育相关基因的表达有影响。     

促红细胞生成素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响

目的:观察促红细胞生成素(eryrthropoietin,EP)对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和细胞周期的影响.方法:无血清条件下,不同剂量(0,0.25,0.5,1,2,10 U/ml)EP与MSCs共培养24 h,MTT方法检测MSC增殖情况;10 U/ml EP与MSCs共培养72 h后,流式细胞仪检测细胞周期情况.结果:MTT结果表明,EP呈剂量依赖性促进MSCs增殖,除0.25 U/ml剂量外,其余各组都与对照组有显著性差异,以10 U/ml EP促MSCs增殖作用最明显.流式细胞检测表明,EP组能降低G0/G1期比例,增加S期和G2/M期细胞比例,与对照组相比,差异均有显著性意义(P＜0.05).结论:EP可以促进骨髓间充质干细胞增殖,并且这种影响呈剂量依赖性.     

以乙肝病毒核心抗原HBcAg为载体的utrophin抗体的制备

目的构建以乙肝病毒HBc为载体的带有utrophin的两个B细胞表位多肽的融合表达质粒pHBc-2UB，表达出融合蛋白并纯化，通过免疫新西兰大白兔获得抗utrophin的抗体。方法通过DNAstarⅡ模拟出utrophin的两个显著优势的B表位。用PCR法合成片段插入HBcAg序列的78位，将该合成片段克隆至pET28a载体中，构建重组表达质粒，表达出融合蛋白HBc-2UB，纯化后免疫新西兰白兔。再将该合成片段克隆至pGEX4T-2载体中，构建重组表达质粒，表达出融合蛋白GST-2UB，用于检测两个表位的抗体。结果测序结果表明重组质粒构建成功，SDS-PAGE电泳显示融合蛋白表达正确，ELISA检测到高滴度抗体。结论以HBc呈现utrophin的B表位被成功表达和纯化，获得高滴度的与两个B表位结合的抗体，为utrophin检测和DMD治疗药物研究打下了基础。     

乙醇对斑马鱼胚胎发育中tenascin-c基因表达的影响

目的 探讨tenascin-c(tnc)基因在斑马鱼胚胎异常发育过程中表达的变化,从而揭示该基因在斑马鱼胚胎发育中可能存在的作用.方法 不同水平乙醇(100、200、300、400、500 mmol/L)持续处理斑马鱼胚胎,制备斑马鱼异常发育模型,收集受精后24、48 h斑马鱼胚胎并固定,用原位杂交和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法观察tnc在斑马鱼异常发育时表达的变化.组间比较采用SPSS 11.5软件进行统计学处理.结果 200 mmol/L乙醇处理的斑马鱼胚胎在受精72 h其他系统未发现发育异常,而心脏已出现畸形.100、200 mmol/L乙醇处理后,RT-PCR结果示tnc在斑马鱼胚胎发育中的表达上调,而原位杂交信号变化不明显;300 mmol/L及以上乙醇处理的胚胎,原位杂交结果示tnc在体节处表达下降;100～400 mmol/L乙醇处理的胚胎,在受精48 h tnc在斑马鱼心脏部位均有表达.结论 tnc在低水平乙醇处理时表达即上调,对胚胎正常发育有保护作用;在心脏异常发育时表达,促进心脏的正常发育;tnc在病理状态下的表达模式不仅在脊椎动物中具有保守性,而且在胚胎和成体时期也具有保守性.     

Tenascin基因在斑马鱼胚胎发育中时空表达规律

目的 观察tenascin-c(tnc)和tenascin-w(tnw)在斑马鱼不同发育时期的时空表达规律,进而揭示tenascin基因与胚胎发育的关系及tnc与tnw在胚胎发育过程中的联系.方法 选择2 hpf(受精后2 h)、4 hpf、8 hpf、10 hpf、24 hpf、48 hpf、72 hpf、7 dpf(受精后7 d)的斑马鱼胚胎,分别提取各组RNA行反转录聚合酶链反应(RT-PCR),并固定各时期胚胎作原位杂交,观察不同时期tnc和tnw在斑马鱼胚胎中时间和空间的表达规律.结果 tnc和tnw在斑马鱼2～10 hpf时均未检测到表达,在24 hpf、48 hpf、72 hpf、7 dpf有表达.tnc在胚胎24 hpf表达于其咽弓、脊索、体节中;在胚胎48 hpf,tnc在其躯干部表达减弱,逐渐局限于尾端,而在胸鳍、听囊、咽弓、后脑有高表达;72 hpf在其体节、胸鳍表达消失,在后脑、咽弓、脊索仍有表达.tnw在24 hpf开始表达于其中脑、后脑和听囊中;48 hpf表达在其体节、脊索,在后脑、听囊中仍有表达,并表达于咽弓;72 hpf在其躯干部的表达开始减弱,在脊索中仍有表达.结论 tnc和tnw在斑马鱼胚胎发育时期具有严格的特异性时空表达规律,二者在斑马鱼胚胎发育过程中有密切联系.     

Lipofectamine TM2000介导pIRES2-EGFP-NT3转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验研究

目的构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3,检测其在阳离子脂质体介导下对新生小鼠离体耳蜗基底膜的转染情况。方法构建含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3后,在阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导下将其转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织,转染后24 h,通过Confocal显微镜观察小鼠离体耳蜗基底膜的转染情况和转染效率。结果成功构建了真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3,通过阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导,该质粒在新生小鼠离体耳蜗基底膜转染的范围内转染进17个细胞,说明该质粒在阳离子脂质体介导下能转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。结论含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3的成功构建,及其在阳离子脂质体介导下对新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的有效转染,为研究NT3基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

汉防己甲素对K562/A02细胞株SORCIN基因表达的影响

本研究旨在探讨汉防己甲素（Tet）在逆转K562/A02细胞耐药与耐药相关的可溶性钙结合蛋白（SORCIN）基因表达之间的关系,为Tet的临床应用提供新的理论基础。通过MTT法筛选出所需浓度Tet,与K562/A02细胞株孵育培养48小时后,通过MTT检测Tet对柔红霉素（DNR）细胞毒性的影响,用RT-PCR方法检测SORCIN基因表达的变化,用Western blot方法检测sorcin表达蛋白的变化。结果表明：在所选浓度范围内,Tet可以增强DNR对K562/A02的细胞毒作用,（Tet浓度为0,0.5,1.0,2.0mg/L时DNR和Tet的IC50分别为11.3±0.17,5.15±0.10,3.91±0.06,2.52±0.04mg/L,p〈0.01）;K562/A02细胞中SORCIN基因高表达,且随着Tet浓度的增加SORCIN的表达先增强后减弱（Tet浓度为0.5mg/L时增强,1.0和2.0mg/L时减弱,p〈0.05）;K652细胞中sorcin蛋白低表达,K562/A02细胞中sorcin蛋白高表达,且随着Tet浓度的增加先增强后减弱（Tet浓度为0.5mg/L时增强、1.0和2.0mg/L时减弱,p〈0.05）。结论：MTT检测显示Tet对K562/A02耐药逆转呈浓度依赖性,Tet可能通过调整SORCIN基因及蛋白的表达参与逆转K562/A02的耐药性,但并不与其耐药逆转作用完全相关。     

促红细胞生成素经磷酸酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途径增强自体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用

目的促红细胞生成素(EPO)通过磷酸酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B(PI3-K/Akt)途径诱导血管生成和抑制细胞凋亡。骨髓间充质干细胞(MSC)移植可以改善心肌缺血后心脏灌注和提高心功能。本研究探讨 EPO 能否增加 MSC 移植效果。方法将32只 Wistar 大鼠随机分为心肌梗死(MI)组、EPO 组、骨髓间充质干细胞移植组(MSC 组)和联合治疗组(MSC-EPO 组),永久结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。通过局部注射的方法将培养的大鼠自体 MSC 移植入梗死区,EPO组及 MSC-EPO 组围手术期每天腹腔注射 EPO(3000 U/kg),共3天,14天后再连续注射3天,术后2天及21天检查二维超声心动图。术后21天用 Western blot 和免疫组化检测评价治疗效果。结果术后21天 MI 组心功能较术后2天明显恶化,而其余三组明显改善,尤以联合治疗组改善最为明显。术后21天,MSC-EPO 组心肌梗死面积(20.7%±2.3%)明显小于 MSC 组(24.0%±2.3%)、EPO 组(26.0%±0.9%)以及 MI 组(28.1%±1.5%)(均P<0.05);MSC-EPO 组毛细血管密度[(12.95±2.11)/视野]明显高于 MSC 组[(10.78±0.99)/视野]、EPO 组[(10.43±1.52)/视野]以及 MI 组[(6.31±0.69)/视野](均P<0.05);Bcl-2明显上调而 Bax 明显下调;磷酸化 Akt 与总 Akt 比值MSC-EPO 组(0.36)高于 MSC 组(0.32)、EPO 组(0.31)以及 MI 组(0.28)(均P<0.05),MSC 组、EPO组与 MI 组比较差异也有统计学意义(均P<0.05)。结论 MSC 移植和 EPO 注射均可改善心肌梗死后心功能。EPO 通过 PI3-K/Akt 途径增加 MSC 移植的治疗作用。     

WDR1与小鼠精神分裂样阴性症状呈正相关性

目的 探讨海马CA1区条件性敲除WDR1与小鼠精神分裂样阴性症状的关系,并进一步分析其潜在神经机制.方法 利用分子生物学手段,构建海马CA1区的WDR1条件性敲除小鼠[CA1-Cre; WDR1flox/flox(CKO)],结合做窝行为学手段、免疫荧光等实验方法观察分析CA1区WDR1在精神分裂样阴性症状中的作用.结果 ①脑片免疫荧光的结果显示WDR1在CKO小鼠中敲除成功;②做窝实验结果显示:WDR1 CKO小鼠做窝质量明显高于WDR1flox/flox小鼠(WT组);③培养海马神经元,免疫荧光染色法显示,CKO小鼠的树突棘密度明显增加.结论 实验结果表明敲除 WDR1能够增加海马CA1区神经元的树突棘,并提高小鼠做窝能力,提示WDR1与小鼠精神分裂样阴性症状呈正相关.