全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

M-CSF和IL-10对人单核细胞表面分子表达的影响

本文采用流式细胞术检测人外周血单核细胞表面CD14、CD2 3、CD6 4、CD11b、CD18、CD2 9表达 ,研究巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF )和白细胞介素 (IL ) 10对单核细胞炎症效应和免疫效应功能的影响。结果显示 ,(1)M CSF诱导单核细胞表面CD14及CD2 3分子的表达 (P <0 0 5 )。IL 10抑制CD2 3的表达 ,促进CD6 4的表达 ,并协同M CSF诱导单核细胞CD14的表达 ,拮抗M CSF对CD2 3的诱导作用。M CSF能协同IL 10对单核细胞CD6 4的诱导作用 ;(2 )M CSF能诱导单核细胞表面CD11b及CD18的表达 (P <0 0 5 )。结论 :M CSF通过促进单核细胞表面CD11b、CD18、CD14、CD2 3的表达及协同促进CD6 4的表达而促进单核细胞粘附、炎性渗出、IgG及IgE依赖的细胞杀伤和吞噬功能 ,促进单核 巨噬细胞在炎症反应、体液免疫应答效应阶段发挥效应细胞功能。IL 10通过促进CD6 4的表达 ,增强体液免疫应答效应阶段单核 巨噬细胞的免疫效应功能 ,但通过抑制CD2 3的表达 ,下调IgE介导的体液免疫效应。     

荧光定量PCR检测c⁃Met CAR病毒感染T细胞的效率

目的：通过设计特异性引物,应用荧光定量PCR方法检测c?Met CAR病毒感染T细胞的效率。方法：应用基因重组技术构建c?Met CAR（GFP）逆转录病毒质粒。应用病毒包装技术制备c?Met CAR病毒与c?Met CAR（GFP）病毒,感染T细胞制备c?Met CAR?T细胞与c?Met CAR?T（GFP）细胞。Western blot检测c?Met CAR和c?Met CAR（GFP）在293T细胞中表达的外源性CD3ζ蛋白。设计特异性引物应用荧光定量PCR检测CAR病毒对T细胞的感染效率,并与流式细胞术的检测结果进行比较。结果：构建c?Met CAR（GFP）质粒,荧光显微镜可观察到c?Met CAR（GFP）质粒在293T细胞上表达绿色荧光蛋白。c?Met CAR和c?Met CAR（GFP）病毒感染的293T细胞可表达外源性CD3ζ蛋白。荧光定量PCR检测c?Met CAR与c?Met CAR（GFP）的感染效率分别为（52.1 ± 1.7）%、（55.9 ± 2.3）%。流式细胞术检测c?Met CAR（GFP）病毒感染效率为（50.7 ± 3.6）%,两种检测方法比较差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：通过设计特异性引物,应用荧光定量PCR方法能够特异性检测 CAR病毒对T细胞的感染效率,该检测方法结果准确、安全,对CAR?T细胞的临床应用具有实用价值。     

全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

维甲酸纳米颗粒混悬剂的制备及对实验性增殖性玻璃体视网膜病变的预防作用

目的:制备维甲酸药物的纳米颗粒混悬剂,并探讨其对兔眼实验性增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的预防作用。方法:采用溶剂分散法制备了维甲酸纳米颗粒混悬剂并对制备条件及配方进行了优化;对维甲酸纳米颗粒混悬剂进行了冷冻干燥;用光子相关光谱(PCS)测定了冷冻干燥前后混悬剂中纳米粒子的平均粒径;透射电镜(TEM)观察其微观形貌;建立了兔眼PVR模型,并考察了维甲酸纳米颗粒混悬剂对PVR的预防作用。结果:混悬剂中维甲酸纳米粒子(RA-NP)的粒径保持在300～400nm之间,大都为完整的球形;PVR预防实验显示,在术后28天,用药组的视网膜脱离发生率较对照组明显减少,且有统计学差异(χ2=19.798,P<0.01),表明维甲酸纳米颗粒混悬剂能够有效的预防PVR的发生。结论:维甲酸纳米颗粒混悬剂有望成为一种新型的PVR治疗用药物载体。     

狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析

目的:利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆?表达?纯化,并对重组 RVG 进行免疫学特性鉴定?方法:参照 GenBank 收录的狂犬病病毒 CVS-11 株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因?RVG 基因经BamHⅠ/KpnⅠ 双酶切后定向克隆到 pFastBac-GP67B 载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac 感受态细胞,经蓝白斑筛选及 PCR 鉴定后获得重组穿梭载体 rBacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达?His-TrapHP 纯化目的蛋白,SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定?重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性?结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000?经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性?结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础?     

Trop2对胃癌细胞耐药性的影响及机制研究

目的：探讨滋养层细胞表面抗原2（Trop2）对胃癌细胞化疗耐药的影响及机制。方法：应用慢病毒转染技术将Trop2 shRNA转染至BGC823细胞株,通过嘌呤霉素筛选出稳定转染质粒的细胞株;qRT?PCR、Western blot和免疫荧光方法检测质粒干扰效率;CCK?8细胞增殖试验和流式细胞术检测柔红霉素对BGC823细胞株增殖能力和细胞凋亡的影响;qRT?PCR、Western blot检测耐药相关基因TopoⅡα的mRNA和蛋白表达变化。结果：在稳定转染Trop2 shRNA质粒的shTrop2组中,Trop2 mRNA及蛋白表达水平较对照组（未处理）和shNC组（转染空载体质粒）明显下调;在相同药物浓度下,柔红霉素对shTrop2组的增殖抑制率明显高于对照组和shNC组,shTrop2组半数抑制浓度低于对照组和shNC组（P＜0.05）,shTrop2组中柔红霉素诱导的细胞凋亡率显著高于对照组和shNC组（P＜0.05）;稳定干扰Trop2表达后耐药相关基因TopoⅡα的表达显著上调。结论：Trop2通过抑制TopoⅡα的表达,可增强胃癌细胞对柔红霉素的耐药性。     

SLC26A4基因频发致聋突变的种族差异及其分子结构分析

目的:SLC26A4基因是导致遗传性耳聋的第二个常见致病基因,在已知耳聋患者中SLC26A4基因突变至少有170种?然而不同地区的耳聋人群突变热点各异,更无SLC26A4致聋性频发突变频率的相关报道,因此本研究对致聋基因SLC26A4频发突变的种族差异及其分子结构进行了深入探讨?方法:依据公共数据库,系统收集1997~2014年全球SLC26A4与耳聋相关的文献报道662篇,基于NEWCASTLE OTTAWA(NOS)标准筛选出31篇文献纳入研究,采用STATA11.2 和RevMan 5.1软件进行了Meta分析,并结合Swiss Model软件对SLC26A4频发致聋突变而导致的蛋白分子结构变异进行比较分析?结果:①发现SLC26A4突变增加耳聋发病风险(OR= 39.73,95% CI: 21.36~73.90,P < 0.001);② SLC26A4突变在亚洲人群中有显著异质性,而欧美地区则无异质性;③鉴定出SLC26A4基因6种高频致聋突变(p.V138F?p.G209V?c.IVS7-2A>G?c.IVS8+1G>A?p.T416P和 p.H723R),并通过蛋白质分子结构模拟发现突变后有意义的结构改变?结论:本研究为SCL26A4致聋突变在不同地区耳聋人群中的遗传学效应研究奠定了基础?     

维甲酸纳米颗粒混悬剂稳定性的研究

研究维甲酸(RA)纳米颗粒混悬剂的稳定性。采用光子相关光谱(PCS)测定了长期放置及冷冻干燥前后混悬剂中纳米粒子的平均粒径和多分散指数(P.I.);用Zeta电位分析仪测定了其Zeta电位,并考察了药物浓度、表面活性剂及pH值对混悬剂稳定性的影响;高效液相色谱法(HPLC)对不同时间混悬剂中全反式维甲酸浓度进行定量测定,绘出了其降解曲线。结果表明,纳米混悬剂的物理稳定性较好,放置及冷冻干燥对其中纳米粒子的粒径及其分布影响不大,其Zeta电位为-33.35±2.7mV,中性环境、无表面活性剂及低药物浓度条件下物理稳定性最好;与溶解状态的维甲酸相比,维甲酸纳米混悬剂的化学稳定性显著改善,有效药物浓度的降解速度明显降低。     

M-CSF、IL-10对单核细胞IL-12、IL-18产生及HLA-DR和CD80表达的影响

目的 :探讨巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)和白细胞介素 10(IL 10 )对人外周血单核细胞分泌IL 12、IL 18及细胞表面HLA DR和CD80表达的影响。方法 :从健康献血员血液中分离单核细胞并进行体外培养 ,分别以M CSF和IL 10单独及共同作用 ,收集上清 ,用ELISA法检测单核细胞IL 12和IL 18的分泌 ,用流式细胞术检测细胞表面HLA DR及CD80的表达。结果 :①M CSF能诱导单核细胞分泌IL 18(P <0 .0 5 ) ;IL 10则能抑制IL 18的产生 (P <0 .0 5 ) ,并拮抗M CSF增强LPS诱生IL 18的作用 (P <0 .0 5 )。M CSF和IL 10均能抑制单核细胞分泌IL 12 p4 0 (P <0 .0 5 ) ,并具有协同效应 (P <0 .0 5 )。②M CSF能诱导单核细胞表面HLA DR的表达 (P <0 .0 5 ) ;IL 10则可抑制HLA DR的表达 ,并拮抗M CSF对HLA DR的诱导作用。M CSF对CD80表达的影响不大 ,IL 10能促进CD80的表达。结论 :M CSF和IL - 10可通过对单核细胞分泌IL 12、IL 18及HLA DR和CD80表达的调节 ,影响T细胞的活化、分化及其介导的免疫应答