TLR/NF⁃κB信号通路在甲基苯丙胺诱导的原代小胶质细胞炎性反应中的作用

目的：探讨Toll样受体（Toll like receptor,TLR）/核因子（nuclear factor,NF）?κB信号通路在甲基苯丙胺（methamphetamine,METH）引起原代小胶质细胞激活及炎性因子释放的作用。方法：分离培养原代小胶质细胞,免疫荧光法鉴定原代小胶质细胞纯度。细胞予METH（300 μmol/L）染毒0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h,蛋白免疫印迹检测原代小胶质细胞的激活情况及其NF?κB通路激活情况,real?time PCR检测炎性因子［肿瘤坏死因子?α（tumor necrosis factor? α,TNF?α）、白介素?1β（interleukin?1β,IL?1β）、白介素?6（interleukin?6,IL?6）］和TLR1~9、11 mRNA的表达。结果：分离出的原代小胶质细胞纯度达到95%以上。METH暴露后原代小胶质细胞激活,其激活标志物IBA?1水平增高,NF?κB通路被激活,炎性因子（TNF?α、IL?1β、IL?6）和TLR2、4~5、7~9、11的mRNA水平明显升高,TLR1的mRNA水平明显降低,差异具有统计学意义（P < 0.05）。结论：METH可通过调节TLR/NF?κB信号通路激活原代小胶质细胞并促进其释放炎性因子,因而TLR可作为METH神经炎性反应干预的潜在靶点,具有一定的治疗意义。     

PFOS对BV-2细胞的炎性损伤及机制研究

目的：探讨环境内分泌干扰物全氟辛磺酸(perfluorooctane suifonate,PFOS)对小鼠小胶质瘤细胞BV-2的损伤作用及其炎性反应。方法：利用体外培养的小胶质细胞,给予不同浓度和作用时间的PFOS进行染毒,通过MTT法检测BV-2细胞活力;实时定量PCR的方法观察诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthesis,iNOS）、白介素（interleukin,IL）-6 和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α mRNA的表达。ELISA法检测炎性因子IL-6,免疫蛋白印迹法检测核转录因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)等信号蛋白表达情况。结果：不同浓度PFOS对BV-2细胞染毒12、24 h后,细胞活力下降,引起明显的细胞损伤。ELISA结果显示, PFOS作用BV-2 24 h后,细胞炎性因子IL-6分泌增加。此外,PFOS还可引起iNOS、IL-6基因表达上调,而TNF-α表达有下降趋势。PFOS与细胞孵育后,炎性通路NF-κB明显激活,表现为磷酸化程度升高。且随染毒浓度的增加,p-NF-κB的表达有上升趋势;此外,随染毒时间的增加,p-NF-κB的表达亦有上升趋势。结论：PFOS可引起BV-2细胞活力降低,激活NF-κB通路,促进炎性因子的释放,该途径可为阐明PFOS引起的神经系统损伤的分子机制提供理论依据。     

孕前炔雌醇暴露对大鼠子代糖代谢变化和肝脏糖代谢相关基因表达的影响

目的 以SD大鼠为模型,观察孕前炔雌醇（Ethinyl estradiol,EE）暴露对子代糖代谢变化和肝脏内与糖代谢相关基因表达的影响。方法 52只雌性大鼠随机分为4组：对照组（芝麻油）、50 μg/kg EE、200 μg/kg EE和800 μg/kg EE组,每天一次,连续灌胃暴露15 d后受孕。在子代出生后第23d（postnatal day,P23）和P25分别进行葡萄糖耐量（OGTT）和胰岛素耐量（ITT）实验,并用RT-PCR检测肝脏中糖代谢相关基因表达水平。结果 子代雌鼠OGTT：200 μg/kg EE组空腹血糖值显著低于对照组（P<0.05）;800 μg/kg EE组第15min血糖值显著高于对照组、50 μg/kg EE、200 μg/kg EE组（P< 0.01,P< 0.01,P< 0.01）,50 μg/kg EE、800 μg/kg EE组2 h血糖值显著低于对照组（P<0.05,P<0.01）。子代雄鼠OGTT：在第15 min,800 μg/kg EE组血糖值显著高于对照组（P<0.01）;第30 min时,200 μg/kg EE组血糖值显著低于对照组（P<0.05）。子代雌鼠ITT：第15 min时,50 μg/kg EE、200 μg/kg EE组血糖值显著高于对照组（P<0.001,P<0.01）。子代雄鼠ITT：第30 min时50 μg/kg EE、200 μg/kg EE组血糖值显著高于对照组（P<0.01,P<0.01）。子代雌鼠RT-PCR：50 μg/kg EE,200 μg/kg EE和800 μg/kg EE组Glut2和Lpk mRNA表达水平显著低于对照组 (P<0.01,P<0.05,P<0.05);50 μg/kg EE和200 μg/kg EE组Gys2 mRNA表达水平显著低于对照组 (P<0.01,P<0.01)。子代雄鼠RT-PCR：200 μg/kg EE组G6pase和Pepck mRNA表达水平显著增高于对照组 (P<0.01,P<0.01),50 μg/kg EE组Glut2 mRNA表达水平相对于对照组显著降低(P<0.01),800 μg/kg EE组 Gys2 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01)。结论 孕前炔雌醇暴露会导致子代雌鼠葡萄糖耐量受损、子代出现胰岛素抵抗及肝脏内糖代谢相关基因表达异常。而且这些效应具有性别差异,子代雌鼠对孕前EE暴露更敏感。     

甲基苯丙胺对大鼠小胶质细胞损伤作用

目的观察甲基苯丙胺(Meth)通过电压门控钾离子通道亚型1.3、1.5(Kv1.3、Kv1.5)对大鼠胎鼠小胶质细胞的损伤作用。方法 SD胎鼠原代培养小胶质细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力和原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡;采用蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应法观察Kv1.3、Kv1.5表达变化。结果 Meth呈浓度依赖性降低小胶质细胞活力,增加小胶质细胞凋亡;Kv1.3的抑制剂MgTx对Meth所致小胶质细胞损伤有部分保护作用;与对照组(1.047±0.165)比较,300μmol/L Meth组小胶质细胞Kv1.3 mRNA表达(7.453±0.675)增高(P<0.05),MgTx组Kv1.3 mRNA表达(1.684±0.875)低于Meth 300μmol/L组(P<0.05);Meth对Kv1.5 mRNA表达无影响。结论 Meth可引起小胶质细胞损伤,其机制可能与Kv1.3表达变化有关。     

甲基苯丙胺引起BV2小胶质细胞炎性反应：基于Toll样受体⁃Peli1信号通路的研究

目的：探讨Toll样受体（Toll like receptor,TLR）?E3泛素连接酶Pellino 1（Peli1）介导的炎性通路在甲基苯丙胺（methamphetamine,Meth）引起BV2小胶质细胞炎性反应中的作用。方法：利用Western blot观察Meth作用后Toll样家族中多种TLR的表达及其下游接头蛋白髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88,MyD88）、β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TIR?domain?containing adaptor inducing interferon?β,TRIF）水平的改变,同时观察上述接头蛋白下游Peli1蛋白的表达,利用ELISA、实时定量PCR（real time?PCR）及Western blot观察Peli1调节的下游炎性因子及信号通路的改变。结果：Meth作用于BV2细胞后,TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR11在特定时间内表达明显上调,同时下游MyD88及TRIF蛋白表达显著增加,其中TRIF具有浓度依赖效应。Meth作用后亦可引起泛素化蛋白Peli1的表达,而利用RNA干扰的方法将Peli1下调后,炎性因子诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）?α、白细胞介素（interleukin? 6,IL）?6表达下降,核因子（nuclear factor,NF）?κB的激活明显缓解。结论：TLR介导的炎性信号在Meth引起BV2细胞炎性反应过程中发挥重要作用。因此,基于TLRs?Peli1靶信号轴的干预可能为Meth神经毒性的干预提供靶点,具有潜在的应用意义。     

双酚A对SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的影响及机制

目的:研究环境内分泌干扰物双酚A(BPA)对SD大鼠血-脑屏障成分表达及星形胶质细胞活力的影响并探讨其损伤机制?方法:通过MTT检测细胞活力,高效液相色谱法(HPLC)检测谷氨酸含量的变化,实时荧光定量PCR检测星形胶质细胞中Claudin-3?Claudin-4?Claudin-5?JAM-1?JAM-2?ZO-1?E-cadherin基因的表达?结果:10-7 mg/ml 的BPA与星型胶质细胞孵育24或48 h后即可引起细胞活力的下降,具有统计学差异?在该浓度的暴露下,血-脑屏障紧密连接相关蛋白Claudin-3?Claudin-4?JAM-1?E-cadherin 蛋白的mRNA水平下调,而Claudin-5?JAM-2?ZO-1蛋白基因表达上调且具有统计学意义;HPLC结果显示,谷氨酸的浓度上调?结论:环境内分泌干扰物BPA对血-脑屏障的完整性具有潜在的损伤作用?     

BPA对中脑后脑边缘处发育的影响

利用斑马鱼作为研究模型探讨BPA对于胚胎神经发育的毒性机制。     

趋化因子受体4在神经胶质瘤中的表达及血管生成中的作用

目的:探讨趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)在神经胶质瘤中的表达及在血管生成中的作用?方法:通过免疫组化法检测正常或神经胶质瘤患者的瘤体组织标本CXCR4?血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,其结果做方差分析及相关性分析;采用ELISA观察CXCR4的配体基质细胞衍生因子-1(stromal derived factor-1,SDF-1)对U87胶质瘤细胞系VEGF分泌的影响;同时利用多种处理方式(对照组?SDF-1处理组?CXCR4拮抗剂AMD3100处理组?CXCR4 RNA干扰处理组)作用于U87后,取其条件培养上清与人脐静脉内皮细胞系(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养,比较小管样结构(tubule-like structure,TLS)生成数量的变化?结果:神经胶质瘤中CXCR4?VEGF的表达量随着肿瘤恶性度的升高而增加,且二者呈线性正相关(P < 0.01)?ELISA实验表明SDF-1可通过CXCR4促进VEGF的分泌(P < 0.01)?成管实验提示CXCR4与胶质瘤血管生成相关?结论:CXCR4与神经胶质瘤恶性度相关,且其配体SDF-1可通过CXCR4影响VEGF的表达,将CXCR4拮抗或干扰明显影响胶质瘤血管增生,提示CXCR4可能为神经胶质瘤的治疗提供相应靶点和思路?     

甲基苯丙胺对大鼠小胶质细胞的损伤及炎性相关基因表达的影响

目的：观察甲基苯丙胺(methamphetamine,Meth)对原代小胶质细胞的损伤及炎性相关基因表达的影响。方法：原代培养SD胎鼠小胶质细胞,利用MTT和原位末端转移酶标记技术(TUNEL)分别检测Meth引起小胶质细胞活力和凋亡的变化。采用实时荧光定量聚合酶链反应法(real-time PCR)观察Meth对小胶质细胞炎性相关因子mRNA表达的影响。ELISA及试剂盒法检测Meth作用后小胶质细胞白介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的分泌改变。结果：MTT实验显示,Meth降低小胶质细胞活力,呈浓度依赖性,浓度为200 μmol/L时与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。TUNEL实验结果显示200 μmol/L Meth可引起细胞凋亡,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。q-PCR结果显示Meth作用于小胶质细胞24 h可降低IL-24、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)表达水平,上调Peli3、Sigma受体1(Sigma receptor 1,Sig1-R)、IL-1β、IL-6、Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)的表达水平,差异有统计学意义(P＜0.05)。此外,蛋白水平亦发现,Meth可促进IL-6和TNF-α的分泌。结论：Meth可降低小胶质细胞活力,诱导小胶质细胞凋亡,并引起IL-1β、IL-1R、IL-6、TLR4等炎性因子mRNA表达变化,促进IL-6和TNF-α的分泌,进而可能损伤中枢神经系统,产生神经毒性。