应用PCR方法对三种新型实验动物钩端螺旋体感染情况的调查研究

目的：建立有效的钩端螺旋体 PCR 检测方法,并对树鼩（（tree shrew, Tupaia belangeri））、长爪沙鼠（ Meriones unguiculatus; Mongolian gerbil）和灰仓鼠（ Cricetulus migratorius）等三种新型实验动物进行感染情况调查。方法针对 NCBI 公布的钩端螺旋体序列,设计并筛选特异性引物,优化 PCR 体系,进行特异性和敏感性测试;并运用优化 PCR 方法对树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠样品进行检测。结果成功建立钩端螺旋体 PCR 检测方法,序列测定验证了该方法的特异性。普通级树鼩钩端螺旋体的阳性率为8.33％,普通级长爪沙鼠钩端螺旋体为100％,清洁级长爪沙鼠和清洁级灰仓鼠钩端螺旋体的阳性率为0％。结论本研究建立了钩端螺旋体 PCR 检测方法,调查了树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠三种新型实验动物的感染情况,为这三种实验动物的研究和使用奠定基础。     

小鼠脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

目的 建立小鼠脑脊髓炎病毒RT-PCR方法并对方法进行初步应用。方法 根据NCBI发表的TMEV GD VII株(GI:62039)基因组序列设计特异引物,建立RT-PCR方法,验证方法的敏感性和特异性;脑腔接种方式感染9只BALB/c小鼠,感染后第6天采集动物的脑、心、肝、脾、肺、肾、盲肠内容物和血清等样本,用建立的方法进行检测;同时检测100份小鼠盲肠内容物样本,对方法进行初步应用。结果 以GD VII RNA为模板,建立的RT-PCR方法能够扩增出约371bp的单一目的条带,敏感性验证显示能够检测到的最低GD VII cDNA量为0.69pg/μL;以脑心肌炎病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、日本乙型脑炎病毒、小鼠诺如病毒及正常小鼠脑组织为对照进行方法特异性验证,均未出现目的条带。脑腔接种感染小鼠,所有小鼠在接种第3天均产生不同程度的精神萎靡后肢麻痹等症状,其中2只小鼠于第5天死亡;采集心、肝、脾、肺、肾、脑、盲肠内容物及血清等样本进行检测,所有小鼠的脑组织均检测到GD VII RNA,而其他组织均未检测到;对100份小鼠盲肠内容物进行检测,结果均为阴性。结论 建立的TMEV GDVII株RT-PCR方法能够高效的检测小鼠组织中的病毒感染,可作为实验动物国家标准的有力补充。     

北京地区实验动物中嗜肺巴斯德杆菌的表型分析

目的对北京地区实验动物中的嗜肺巴斯德杆菌分离株进行表型分析,提高检测的准确性。方法通过生化鉴定和16S rDNA测序,对306株嗜肺巴斯德杆菌可疑菌株进行鉴定。结合分离株在血琼脂平皿上的菌落特征和生化特性,组成53个特征数据谱,进行表型特征的聚类分析。结果 306株分离株中,BD自动细菌鉴定系统和16S rDNA测序鉴定出嗜肺巴斯德杆菌的阳性率分别为164/306和227/306。227株嗜肺巴斯德杆菌真阳性的表型特征共有140种,Heyl型106种,Jawetz型23种。结论北京地区实验动物中嗜肺巴斯德杆菌主要为Heyl型感染,Jawetz型较少,表型特征多样,分布广泛。     

实验动物金黄色葡萄球菌的实验室检测能力验证结果评价

目的 通过实施实验动物金黄色葡萄球菌检出能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法 按照CNAS批准的能力验证方案,通过低温冻干制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果 共有28个实验室参加本次能力验证项目,其中获得满意验证结果的实验室为22个,占总参加机构的78.57%;未得到满意验证结果的实验室为6个,占21.43%。采用国标检测方法的有27个,采用PCR检测方法的有1个。结论 实验动物质量检测机构对金黄色葡萄球菌的检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。     

普通环境长爪沙鼠呼吸道菌群的分离鉴定

目的调查普通环境长爪沙鼠呼吸道细菌及支原体携带情况,为制定长爪沙鼠微生物学等级标准提供依据。方法对普通环境饲养的65只长爪沙鼠进行解剖,取气管分泌物接种血琼脂,分别放入普通培养箱和5%CO2培养箱中培养48 h,分离菌株后同时进行生化分析和PCR测序鉴定,以期准确判断分离菌株所属菌属;气管浸液提取DNA,用支原体特异性引物进行PCR检测,并分别计算检出率。结果本研究共检出22种细菌及支原体。不同细菌、支原体感染率相差很大,阳性率在1.5%(1/65)到64.6%(42/65)之间,其中部分细菌为大鼠和小鼠致病菌。结论本研究为长爪沙鼠的微生物学等级标准的制定提供了参考数据。     

融水小型猪的实验动物化系列研究概述

融水小型猪的种源来自广西融水县,2012年被引到广东繁育并测定了基础数据,包括种质特性、繁殖性能、生长曲线、血液学指标、血生化指标、脏器系数、染色体分析。参照国家和地方有关实验动物标准,初步建立了融水小型猪微生物与寄生虫、环境与设施、饲料、病理学、遗传学等质量控制标准。融水小型猪能适应当地气候,繁殖良好,自然受孕率为88.3%,妊娠期平均112 d,初产平均胎产仔6.1头,经产平均产仔7.9头。融水小型猪体型小,雌雄成年体重(6月龄)分别为17.21±5.20 kg和16.35±5.23 kg,性情温顺,线粒体DNA分析表明融水小型猪比兰屿猪更为古老。通过标准化的饲养管理与质量控制,具有培育成实验用小型猪的基本条件。     

巴斯德杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立巴斯德杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为实验动物的呼吸道细菌的控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对Genbank中13株巴斯德杆菌的RNA聚合酶β亚基(rpo B)氨基酸序列设计简并引物。对建立CODEHOP PCR方法用21株参考菌株进行特异性和敏感性评价,并应用于实验动物中的巴斯德杆菌检测。结果简并引物Past F6/PastR5扩增标准菌株的目的片段为200 bp左右。能够区分受试的巴斯德杆菌和主要的实验动物呼吸道病原菌。敏感性为0.2 pg/μL~2 pg/μL。在受试的609只实验动物中呼吸道样品中检测出巴斯德杆菌阳性率为19.1%。样品阳性片段经测序验证,准确率为100%。结论所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于动物样品中巴斯德杆菌的检测。     

鼠肺炎病毒实时荧光定量聚合酶链反应方法的建立及其在新型冠状病毒感染模型用小鼠等动物检测中的应用

目的 建立鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice,PVM）实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR）检测方法,用于新型冠状病毒感染模型用小鼠等实验动物及其动物相关样本的检测。方法 选择PVM G基因保守序列设计合成引物和探针,建立Q-PCR方法。并进行方法的线性、特异性、敏感性、重复性、稳定性和可信度验证。应用建立的方法对包括用于构建新型冠状病毒感染模型用hACE2等8个品系142只小鼠,及15只大鼠、5只沙鼠、4只黄鼠、63只裸鼹鼠和19只PVM感染小鼠的肺组织样本进行PVM检测。结果 建立的方法与仙台病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、汉坦病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒无交叉反应。方法的线性范围为1×101～1×108拷贝/μl,检测病毒质粒标准品灵敏度达101拷贝/μl;重复性、稳定性结果显示实验内和实验间平均变异系数均<5%。用建立的方法检测用于构建新型冠状病毒感染模型用hACE2等8个品系142只小鼠,及15只大鼠、5只沙鼠、4只黄鼠和63只裸鼹鼠...     

树鼩巴尔通体PCR方法的建立及初步应用

目的建立有效的树鼩巴尔通体PCR检测方法,并进行初步应用。方法针对NCBI公布的巴尔通体序列设计3对引物,通过对我国主要流行菌株的扩增实验来确定1对引物,并进行体系优化、特异性和敏感性测试;运用该PCR方法对60份树鼩样品进行检测,阳性样本进行序列测定。结果所建树鼩巴尔通体PCR检测方法特异性良好,灵敏度较高(2.0×10-5μg/mL),60份树鼩样本中有15份阳性样本,通过序列测定证实树鼩巴尔通体感染率为25%,与扩增结果完全相符,验证了该方法的可行性。结论该方法的建立为树鼩巴尔通体的检测奠定了基础。     

仙台病毒RT-PCR检测方法的建立及灰仓鼠中流行情况调查

目的建立仙台病毒(SV)RT-PCR检测方法,并对灰仓鼠仙台病毒感染情况进行调查。方法根据NCBI发表的SV(gi:9627219)基因组序列设计引物,建立RT-PCR方法,对方法的特异性和灵敏性进行验证,并用该方法检测60份灰仓鼠的肺脏样本。结果建立的SV RT-PCR方法显示有较好的敏感性和特异性:以仙台病毒为模板扩增产生197 bp的单一目的条带,经测序比对与NCBI数据库中SV相关序列的一致率为98%,而以猴副流感病毒(SV5)、犬瘟热病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型及腮腺炎病毒为对照无任何条带产生;能检出的SVcDNA最低浓度是96.8 ng/mL;用该方法检测60份灰仓鼠,SV的感染率为3.33%(2/60)。结论建立的SV RT-PCR方法可用于实验类啮齿动物动物SV的常规检测,自然条件下灰仓鼠感染SV的问题不容忽视。