罗汉果苷IIIE的酶法定点糖基化修饰

罗汉果苷是由罗汉果Siraitia grosvenorii生物合成的四环三萜类皂苷。基于甜度高、热量低和口感好等优点,罗汉果苷已成为开发全新非营养型天然甜味剂的重要来源。本研究以甜度为蔗糖300倍且口味较好的罗汉果苷IIIE为模型化合物,利用糖基转移酶对11位羟基进行糖基化修饰,研究其与罗汉果苷类化合物甜度和口味的构效关系。通过糖基转移酶库的筛选,获得了能够区域选择性糖基化罗汉果苷IIIE 11位羟基的糖基转移酶HXSW-GT-2,然后经诱导表达条件优化实现了该酶在大肠埃希菌中的高效可溶性表达。在此基础上,通过对HXSW-GT-2反应条件如反应pH、温度、二磷酸尿苷葡萄糖二钠盐用量、反应时间等系统优化,罗汉果苷IIIE糖基化的转化率被提高至85%以上,扩大反应体系后纯化得纯度大于95%的糖基化产物MG-IIIE-Glu。口感测试结果表明,与罗汉果苷IIIE和5%蔗糖溶液相比,MG-IIIE-Glu的甜度基本消失,苦涩味明显。本研究初步阐释了11位羟基与罗汉果苷甜度和口感的构效关系,为该类天然甜味剂的构效改造和开发提供理论指导。     

丙氨酸依赖型转氨酶高通量快速检测方法的建立

本研究以来源自Vibrio fluvialis JS17的丙氨酸依赖型转氨酶VfTA为研究对象,偶联丙酮酸氧化酶和辣根过氧化物酶,建立了一种基于反应液颜色变化的转氨酶活性测定新方法,反应条件优化后,考察了VfTA活力单位数与反应液400 nm处吸收度的线性关系,并将此法用于商业化转氨酶ATA117活力的研究。结果显示:该法对转氨酶VfTA的活力检测限可达0.45 U/mL,对ATA117的活力检测限可达0.5 U/mL,并且可根据反应液颜色深浅初步判断酶活力情况。     

链霉菌沉默生物合成基因簇激活策略的研究进展

微生物次级代谢产物因其显著的生物活性一直是新药发现与开发的重要来源之一,激增的基因组信息表明,链霉菌中存在着巨大的生物合成潜力。但目前从链霉菌中挖掘的具有新骨架或新结构单元的活性次级代谢产物数量远低于生物合成基因簇的数量,原因主要在于很多生物合成基因簇在常规实验条件下表达微弱或转录沉默。从预测生物合成基因簇的生物信息学工具入手,本文重点阐述了在天然宿主和异源宿主中激活链霉菌沉默生物合成基因簇的经典方法和最新策略,包括转录因子诱捕、报告子导向的高通量筛选以及多重CRISPR-TAR等,为挖掘链霉菌新型次级代谢产物提供了方法学参考。     

双羰基还原酶催化的两步羰基还原反应

双羰基还原酶(diketoreductase)选择性催化β,δ-二羰基酯底物还原生成相应的双羟基产物,其对映体过量(ee)和非对映体过量(de)均大于99.5%。为阐明该独特酶促反应的催化机制,研究了双羰基还原酶催化的双羰基反应过程及其反应特征。通过反应历程监测发现在双羰基还原及其逆反应过程中均生成两个单羟基中间产物。这两种单羟基中间产物经反相C₁₈色谱法分离纯化,并采用手性分析鉴定了其立体化学特征。两个中间产物可以作为双羰基还原酶的底物被选择性还原,但具有不同的反应速率。反应温度和底物浓度对中间体的形成和消失有较大的影响。此外,初级稳态动力学显示两个中间产物的消除反应速率也不尽相同。结果表明,双羰基还原酶催化的双羰基还原是一个伴有中间产物的生成与消失的两步反应过程,并且反应速率有所不同。     

罗汉果苷ⅢE的酶法合成

为开发罗汉果苷ⅢE的简易制备方法,为开发罗汉果苷类甜味剂提供参考依据。本研究以罗汉果苷Ⅴ为探针筛选糖苷水解酶库,获得了能够区域选择性合成罗汉果苷ⅢE的CPU-GH17,通过考察异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导温度和时间等参数建立了CPU-GH17的高效可溶性表达条件:0.4 mmol/L IPTG、15 ℃和12 h。在此基础上,针对反应pH、温度、酶量、底物浓度以及反应时间等参数进行系统优化,最终确定pH 6.0、45 ℃、3 U/mL酶、5 mg/mL底物和20 h时,罗汉果苷Ⅴ可以完全转化成罗汉果苷ⅢE。本研究成功地开发了基于CPU-GH17的罗汉果苷ⅢE的酶法合成新工艺,并验证了其规模化生产的可行性。     

光-酶催化偶联方式的研究进展

光-酶催化的偶联能够实时可逆、时空高效地调控酶的活性或拓展酶的功能,这一过程通常需要通过光响应结构将光能转化为酶所能利用的物理化学能,从而影响酶的活性和功能。目前研究的光-酶催化的偶联主要有4种方式：1.酶催化与能够在光照条件下发生异构体转换的小分子结构光开关偶联;2.酶催化与能够在光照条件下从保护基团离去的小分子结构光笼基团偶联;3.酶催化与能够在光照时发生构象改变的光感受器蛋白偶联;4.酶催化与光催化偶联,即光生物催化。应用这些光响应结构的偶联方法在酶的活性功能调控方面已经有比较成熟的技术,在体外催化体系中调控酶活性、拓宽酶的反应类型,以及体内调控生物过程、药物研发等领域都有广阔的前景。文章将主要介绍上述4种光-酶催化的偶联方式和应用,并探讨这些方法的未来发展方向。     

TAR克隆技术及其在微生物次级代谢产物研究中的应用

微生物次级代谢产物结构多样、种类丰富,是新药发现的重要来源。微生物次级代谢产物由特定生物合成基因簇编码合成,通常与微生物的生长繁殖无关。由于实验室可培养微生物的数量较少,而且多数可培养微生物存在基因簇沉默的现象,严重阻碍了微生物来源药物的研究和开发。微生物生物合成基因簇的异源表达及生物合成相应的次级代谢产物已逐渐成为发现新颖活性化合物的有效手段之一。作为研究微生物次级代谢产物的重要工具,基于TAR(transformation associated recombination)克隆技术的异源表达策略可实现绝大多数基因簇的完整异源表达。本文从TAR克隆技术的原理、应用和策略改进3个方面,总结了基于TAR克隆技术的微生物次级代谢产物异源生物合成的研究进展,为研究和开发新型微生物来源药物提供方法学借鉴。     

糖基转移酶在改善天然产物成药性方面的应用

天然产物结构新颖、生物活性多样,是药物或药物先导化合物的重要来源之一。但是,目前仅有极少数的天然产物被开发成药,生物活性不佳、溶解度低或稳定性差等是造成其成药性不佳的主要原因。鉴于天然产物结构的复杂性,通过化学结构修饰提高成药性受到了极大的挑战和限制,因此,更加多元化的酶法结构改造逐渐成为天然产物结构修饰的重要手段之一。由于选择性强、效率高、反应温和等优势,基于糖基转移酶的酶法糖基化修饰在改善天然产物成药性方面展现出了良好的应用前景。本文概述了糖基转移酶及其在天然产物结构修饰中的应用和挑战,可为天然产物的新药开发提供一定的参考和借鉴。     

microRNA定量检测方法的研究进展

随着对microRNA(miRNA)种类、结构和生物学功能研究的不断深入,其在生物发育、代谢调控、疾病发生与治疗干预等方面的重要性受到了广泛关注。由于miRNA稳定性差、表达量低和序列差异小等特征,建立快速简便、灵敏度高、特异性强的miRNA定量检测方法对研究这类生物活性分子的功能至关重要。本文对miRNA的定量检测方法进行分析和比较,为选择合适的miRNA检测方法开展生物学功能研究提供参考和借鉴。