星形胶质细胞来源的GJA1⁃20k在氧化应激后参与神经元保护作用的机制

目的：观察星形胶质细胞（astrocyte）通过上调神经元（neuron）内源性缝隙连接蛋白α1截短单体?20k（gap junction protein alpha 1 truncated monomer? 20k,GJA1?20k）参与氧化应激损伤后神经保护作用的机制。方法：采用C57BL/6胎鼠以原代培养法获取神经元及星形胶质细胞,建立共培养模型,给予神经元过氧化氢（H2O2）损伤,及星形胶质细胞胰岛素样生长因子1（insulin?like growth factor?1,IGF?1）受体阻滞剂AG1024,分别设立Neuron组、Neuron+Stress组、Neuron+Astrocyte +Stress组及Neuron+Astrocyte+Stress+AG1024组,通过Western blot测定神经元GJA1?20k、去磷酸化（non?phosphorylated,NP）?Cx43的表达,谷氨酸转运酶（glutamate transporter?1,GLT?1）、线粒体功能相关蛋白（PGC?1α、mtTFA、Tom20、CoxⅣ）、凋亡相关蛋白（Bcl?2、Bax、Caspases?9）的变化,采用酶联免疫荧光分析（ELFA）及ELISA法分别检测氧化应激因子NAPDH 氧化酶活性和白介素（interleukin,IL）?1β、IL?6、肿瘤坏死因子?α（tumor necrosis factor?α,TNF?α）等炎性因子含量的变化,采用Annexin V?FITC/PI测定神经元凋亡。结果：星形胶质细胞共培养可明显上调在神经元氧化损伤后内源性GJA1?20k和NP?Cx43表达,抑制PGC?1α、mtTFA、Tom20、CoxⅣ的下调,上调凋亡抑制因子Bcl?2表达,下调凋亡促进因子Bax、Caspase?9表达,降低NAPDH氧化酶活性,降低炎性产物IL?1β、IL?6和TNF?α的水平及抑制神经元的凋亡（P < 0.05）。在给予AG1024后,可明显抑制与以上因素相关的星形胶质细胞对神经元的保护作用（P < 0.05）。结论：与IGF?1相关的星形胶质细胞对神经元的保护机制可能与增加神经元内源性GJA1?20k的含量及线粒体功能的保护有关。     

抑制ERK1/2对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的 探讨抑制细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2对脑缺血再灌注（I/R）损伤大鼠的作用及对缝隙连接蛋白（Cx）40/Cx43异型缝隙连接表达以及核因子-κB（NF-κB）相关炎症因子p-IκBa、肿瘤坏死因子（TNF）-α及干扰素（IFN）表达的影响。方法 选取成年雄性100只大鼠随机分为5组,每组20只:假手术组（仅暴露双侧颈总动脉而不夹闭）;治疗组4 h组和治疗组8 h组（I/R后立即腹腔注射ERK1/2特异性抑制剂SCH772984,25 mg/kg）;④溶媒组（I/R后立即腹腔注射溶媒二甲基亚枫）;⑤模型组（阻断双侧颈总动脉血流30 min后,恢复血流,产生I/R损伤）。采用神经功能损伤程度量表（NSS）评分评估大鼠神经功能。采用干湿重法测定脑组织含水率。采用免疫印迹法测定损伤侧海马区皮质p-IκBa、TNF-α及IFN的表达,采用免疫共沉淀法检测Cx40/Cx43异型连接表达。结果 模型组NSS评分脑含水率、p-IκBa、TNF-α、IFN及Cx40/Cx43异型连接的表达水平较假手术组均明显增高（P<0.05）,SCH772984干预后,均明显下降（P<0.05）。结论 抑制ERK1/2途径,可明显抑制Cx40/Cx43异型连接和NF-κB,减少炎症因子,缓解脑水肿,从而改善大鼠神经功能。     

与缺氧诱导因子-1 α调控相关的缝隙连接 43蛋白磷酸化参与脑缺血再灌注损伤的机制

目的观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)所致的缝隙连接43蛋白(connexin43,Cx43)磷酸化对脑缺血再灌注(cerebral ischemia and reperfusion,I/R)损伤的相关机制。方法选取成年SD雄性大鼠100只,随机分为4部分5组,每组20只:(1)假手术组,仅暴露双侧颈总动脉而不予夹闭;(2)治疗组,I/R后立即腹腔注入HIF-1α特异抑制剂2甲氧基本雌二醇(2ME2) 15 mg/kg,实验时间设定为I/R后4 h及8 h;(3)溶媒组,以溶媒二甲基亚枫(DMSO)替代2ME2;(4) I/R损伤组,I/R形成后不给予处理,(3)和(4)实验时间均设定为I/R后8 h。每组取10只动物行脑组织含水量测定;另10只动物在预定时间取海马区域皮质标本,采用免疫印迹法(Western blot,WB)检测磷酸化Cx43(p-Cx43)、Bcl-2、Bax、Caspases-3的表达水平,并用酶联免疫法(ELISA)检测海马皮质组织中炎性因子的含量,用干蒸法测定脑水肿的程度。结果采用2ME2干预的治疗组大鼠各时间段的脑含水量及海马皮质组织的p-Cx43、炎性因子、Cx40、凋亡促进因子Bax、Caspases-3表达水平均明显降低(均P 0. 05),凋亡抑制因子Bcl-2表达水平明显升高(P 0. 05)。结论通过特异性抑制HIF-1α的形成,可降低神经细胞Cx43磷酸化的形成,明显降低炎性因子的分泌;并可对脑I/R所致的损伤产生缓解作用;对脑缺血疾病在超急性期的治疗有着重大的意义。     

cAMP对大鼠颅脑损伤后神经功能及脑水肿的影响

目的 探讨蛋白激酶A（PKA）激活物cAMP对颅脑损伤（TBI）大鼠神经功能、脑水肿的影响。方法 选取120只成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组20只）:假手术组（暴露硬脑膜而不给予液压打击）;高、中、低剂量cAMP组（TBI后1 h腹腔注射60、40、20 mg/kg PKA激活物8-Bromo-cAMP）;溶媒组（TBI后1 h腹腔注射cAMP溶媒二甲基亚砜10 μl）;模型组（液压打击处理）。TBI后48 h,采用神经损伤严重程度评分（NSS）评估神经功能,干湿重法测定脑含水量,免疫印迹法检查海马细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、非磷酸化缝隙连接蛋白43（NP-Cx43）、谷氨酸转运蛋白-1（GLT-1）及钠钾ATP酶的表达,高效液相色谱法检测海马谷氨酸（Glu）的含量。结果 TBI后,大鼠NSS明显增高（P<0.05）,脑含水量明显增加（P<0.05）,海马ERK1/2表达水平明显增加（P<0.05）,海马Glu含量明显增加（P<0.05）,而NP-Cx43、GLT-1、钠钾ATP酶表达水平明显降低（P<0.05）;cAMP干预后,显著逆转这些反应（P<0.05）,而且呈剂量依赖性。结论 大鼠TBI后,给予cAMP干预,激活PKA,可通过门卫效应抑制ERK1/2,使NP-Cx43、GLT-1及钠钾ATP酶水平明显增高,进一步降低Glu等脑毒性代谢产物、缓解脑水肿,从而改善大鼠神经功能。     

人参皂甙Rb1通过调控缝隙连接蛋白40治疗脑缺血再灌注损伤的机制

目的观察人参皂甙Rb1(GS-Rb1)通过调控缝隙连接蛋白40(Cx40)表达在治疗脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia and reperfusion injury,Cerebral I/R injury)的相关性机制。方法选取100只体重350～450 g的4月龄的SD雄性大鼠随机分为5组,每组20只,脑缺血再灌注模型建立为采用夹闭颈总动脉法。具体分组为:(1)假手术(sham)组;(2) GS-Rb1(I/R+GS-Rb1)治疗组;(3) GS-Rb+H-89阻断(I/R+GS-Rb1+H-89)组、(4)溶媒(I/R+DMSO)组及;(5)损伤(I/R)组,每组20只。实验时间均设定为I/R后8 h。每组取10只大鼠进行行为学检测和脑组织含水量测定,另10只则获取海马区皮质通过蛋白免疫印记法(Western Blot,WB)测定神经元Cx40蛋白的变化、采用酶联免疫荧光(ELFA)及酶联免疫吸附(ELISA)检测神经元氧化应激因子NAPDH氧化酶活性、炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-a等含量的变化。结果实验结果显示,治疗组的NSS评分、脑水肿程度、NAPDH氧化酶活性、炎性因子及海马皮质Cx40表达均较溶媒组及损伤组明显下降(P 0. 05)。而H-89可明显抑制上述GS-Rb1对Cx40蛋白表达下调、降低NAPDH氧化酶活性及缓解炎性因子产生的作用(P 0. 05)。结论 GS-Rb1可能通过激活PKA途径而对Cx40蛋白表达下调,从而产生抑制损伤性物质的释放及传递,以达到脑损伤缓解作用。