脂蟾毒配基对人胃癌BGC-823细胞系细胞生长的干预效应

目的：观察中药蟾酥主要成分之一——脂蟾毒配基对体外培养人胃癌BGC-823细胞系细胞生长的干预及其与细胞色素C和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化的关系。 方法：实验于2004—09／2005—12在北京大学医学部细胞生物学系实验室完成。体外培养人胃癌BGC-823细胞系，脂蟾毒配基各组加入不同浓度的脂蟾毒配基（先用二甲基亚砜溶解，再经RPMI-1640培养液稀释至终浓度。细胞增殖及增殖抑制实验、细胞核形态观察及核DNA含量测定实验中脂蟾毒配基浓度分别为0．1，1，10μmol／L；细胞周期分布实验、细胞凋亡率实验、线粒体膜电位实验中脂蟾毒配基浓度分别为0，1,2．5，5μmol／L）。空白对照组加入RPMI-1640培养液。盐酸阿克拉霉素组加入5μmoL／L盐酸阿克拉霉素。采用酸性磷酸酶法检测细胞增殖抑制作用；细胞荧光分光光度仪观察细胞核形态及核DNA含量测定；流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及其线粒体膜电位变化；Western blot检测与细胞凋亡相关基因蛋白表达的变化。 结果：①经0．1，1，10μmol／L脂蟾毒配基分别作用24，48，72h后，细胞生长显著抑制，脂蟾毒配基对癌细胞的生长抑制百分率与剂量、时间呈正相关，其IC50分别为3．9，2．0，1．5μmol／L。②随脂蟾毒配基作用浓度和时间的延长，癌细胞核荧光强度减弱，细胞核DNA含量明显降低。③0．1，1μmol／L脂螗毒配基作用24～48h后癌细胞阻滞在S期，5μmol／L脂蟾毒配基作用72h时，细胞阻滞在G2＋M期；盐酸阿克拉霉素与癌细胞作用24～48h，细胞阻滞在S期，作用72h时细胞阻滞在G2＋M期。④脂蟾毒配基作用后，细胞凋亡率明显高于对照组。⑤脂蟾毒配基引起细胞线粒体膜电位下降，释放人胞质中的细胞色素C增多，促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白活化，抑制Bel-2蚤白表达，诱导细胞凋亡。 结论：体外实验条件下，脂蟾毒配基抑制人胃癌BGC-823细胞生长并诱导细胞发生凋亡，其诱导凋亡作用机制与线粒体通路有关。     

熊果酸诱导脑胶质瘤U251细胞株凋亡及其机制

目的：探讨熊果酸(Ursolic acid, UA)诱导脑胶质瘤U251细胞株凋亡的作用及机制。方法：培养脑胶质瘤细胞株(U251)，应用流式细胞仪观察UA对细胞周期的影响；琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA的变化；Western-blot测定COX-2及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达。放射免疫分析法测定COX-2催化产物前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)。结果：流式细胞术及琼脂糖凝胶电泳均显示UA诱导U251细胞凋亡，细胞核DNA 呈梯状降解。同时COX-2蛋白表达及其催化生成产物PGE2浓度下降，凋亡相关蛋白Bcl-2表达减少，而Bax无明显变化。结论：熊果酸能明显诱导U251细胞凋亡，其机制可能与阻滞细胞周期、抑制COX-2表达、减少PGE2生成及下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达有关。     

利用CRISPR/Cas9技术构建22q-Enh3增强子元件敲除型A549稳定细胞系

目的 增强子元件敲除细胞系是探索增强子功能的理想细胞模型,为了探索位于22q12.2肺癌易感染色质区的增强子元件22q-Enh3的生物学功能,建立敲除22q-Enh3增强子元件的纯合细胞系.方法 利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated 9)基因敲除技术在非小细胞肺癌A549细胞系中敲除22q-Enh3增强子,并运用流式细胞术、细胞培养以及PCR技术筛选和鉴定敲除型克隆.结果 我们最终获得了3个敲除增强子元件22q-Enh3的纯合子细胞克隆.结论 本研究为进一步研究22q-Enh3增强子元件的生物学功能提供了细胞模型,并为应用CRISPR/Cas9基因敲除技术建立其他增强子元件敲除型纯合子细胞模型积累了宝贵经验.     

白杨素对人肝癌BEL-7402细胞表面超微结构和蛋白质磷酸化及相关通路的影响

背景：白杨素是保健食品和中草药中常见的具有防癌抗癌活性的食源黄酮类天然产物。白杨素是否有助于防治肝癌？其作用机制为何？是否促进肝癌干细胞的分化？对此尚缺乏系统研究。目的：以人肝癌细胞为对象,揭示白杨素的亚细胞和分子作用机制。方法：应用酸性磷酸酶实验、扫描电镜、免疫印迹技术探讨白杨素对BEL-7402细胞的作用及其机制。结果与结论：白杨素显著抑制BEL-7402细胞的体外增殖,半数抑制浓度IC50为24.9mol/L或6.3mg/L。白杨素与PI3K-AKT途径特异性抑制剂LY294002联用具有显著的协同抗癌效应。但白杨素本身并不改变AKT、磷酸化pAKT、AKT下游分子GSK-3和磷酸化pGSK-3的表达水平,虽然高剂量下β-catenin略有下调。白杨素导致细胞表面微绒毛样突起密度明显增加并形成纳米膜粒;细胞回缩,间隙加宽;出现形态上不同于凋亡的死亡细胞。白杨素显著改变多种蛋白质的丝/苏氨酸磷酸化水平;对酪氨酸磷酸化亦有广谱下调作用,接近于表柔比星对照。白杨素对CDK1、磷酸化pCDK1和pCDK2、CDC25A、CDC25B和CD133均无明显影响,但可剂量依赖性诱导PARP-1降解。总之,白杨素对BEL-7402细胞的抑制作用并非起因于PI3K-AKT和Wnt/β-catenin通路阻断或细胞周期核心调控因子阻断,而更可能起因于生物膜功能障碍所致细胞表面超微结构和蛋白质磷酸化的大范围改变,并以非经典方式诱导肝癌细胞死亡。     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子介导的E1A和IL-24双基因靶向腺病毒载体,获得Ad-h-E1A-IL-24靶向重组病毒子,并探索其体外抑瘤作用。方法运用PCR扩增MCF-7乳腺癌细胞的DNA,XbaⅠ和HindⅢ酶切获得280 bp hTERT启动子,插入空载体构建成pTrack-hTERT;运用PCR及HindⅢ和XhoⅠ酶切获得E1A,与pTrack-hTERT构成pAdTrack-hTERT-E1A;运用PCR及NotⅠ和SalⅠ酶切获得IL-24,插入pTrack-PP-IRES;XbaⅠ和XhoⅠ酶切获得hTERT-E1A,与pTrack-PP-IL-24-IRES形成pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,同源重组、包装和扩增获得Ad-h-E1A-IL-24重组靶向病毒子。用25 MOI重组靶向腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-h-E1A-IL-24的细胞生长抑制作用。结果成功构建pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,并获得Ad-h-E1A-IL-24重组病毒子。与非靶向双基因比较,Ad-h-E1A-IL-24组可明显抑制肿瘤细胞生长（P〈0.05或0.01）。结论Ad-h-E1A-IL-24靶向腺病毒载体的体外抑瘤作用优于非靶向双基因载体。     

β-淀粉样蛋白影响维甲类X受体α到细胞质的穿梭

目的 探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)对维甲类X受体α(RXRα)生成及到细胞质迁移的影响。方法 将野生型小鼠脑神经瘤细胞(N2awt)分为对照组和实验组,采用Aβ短肽及淀粉样肽前体蛋白(APP)695过表达处理实验组,应用核质分离结合Western blot方法,检测RXRα在细胞核和细胞质中的含量;分别对上述2组N2awt细胞及阿尔茨海默病(AD)患者及健康对照者的脑组织切片进行免疫荧光定位染色,观察RXRα在细胞核与细胞质中分布的改变。结果 在N2awt细胞中,APP或Aβ增多不影响RXRα的表达但导致RXRα在细胞质中含量与分布增多,分别从对照组的3.2％增加至APP处理组的17.6％及从对照组的3.8％增加至Aβ处理组的14.3％;与健康人比较,AD患者脑皮质细胞中RXRα在细胞质分布增加。结论 Aβ可能影响RXRα到细胞质的穿梭。     

他莫昔芬体外促进HepG2细胞脂肪变性观察

目的：研究他莫昔芬（TAM）对体外培养的HepG2细胞脂肪变性以及脂类代谢调控关键因子表达的影响。方法应用油酸（50μmol/L）处理HepG2细胞,诱导细胞脂肪变性体外模型,同时给予不同浓度的TAM （5～20μmol/L）干预72 h;采用油红O染色和甘油三酯含量测定检测HepG2细胞内脂质聚集情况;应用蛋白印迹法检测固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、肉酯软脂酰基转移酶（CPT1）和微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）的表达;采用细胞活性检测试剂盒测定细胞活性。结果在干预72 h后,模型组细胞内甘油三酯含量为（16.53＆#177;0.17） mg/100 mg蛋白质,在5μmol/L TAM处理细胞内甘油三酯含量为（17.77＆#177;0.05） mg/100mg蛋白质,与模型组无显著性差异,但在10μmol/L和20μmol/L TAM处理组较模型组分别增加了31%[（21.57＆#177;0.16） mg/100 mg蛋白质]和44%[（23.82＆#177;0.44） mg/100 mg蛋白质],（P＆lt;0.05）;TAM上调细胞内SREBP-1c、FAS、SCD和MTP蛋白表达,但并不改变CPT1蛋白表达;TAM在5～20μmol/L范围内不影响HepG2细胞活性。结论 TAM可促进油酸诱导的HepG2细胞脂肪变性,其主要机制可能是通过上调SREBP-1c及其下游基因,如FAS和SCD的表达而增加了脂肪酸的合成。     

重编程诱导多功能干细胞的研究进展

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been first induced from mouse fibroblasts since 2006, and the research on iPSCs has made great progress in the following years. iPS cell lines were established from different somatic cells through DNA, RNA, protein, and small molecule compounds and various methods of transduction, making the induction of iPSCs more secure and effective, and more attractive prospect of clinical application. In this review, different somatic cell reprogramming, different levels of reprogramming, different transduction pathways, and prospect of application are discussed.     

特发性男性不育的分子遗传学诊断与生育指导

特发性男性不育是指男性不育症患者除有精子异常外,其余情况均正常,而患者出现精子异常的原因不明.研究证明,Yq11中无精子因子(azoospermia factor,AZF)的缺失,可引起不同程度的生精障碍[1],但随着辅助生殖技术的发展,AZF缺失患者依然可以生育后代,并且不同缺失类型辅助治疗对策各异.因此,有必要对特发性男性不育患者进行Y染色体AZF区域微缺失研究,从而对该类患者的诊断和生育指导提供依据.     

白杨素对人肝癌BEL-7402细胞表面超微结构和蛋白质磷酸化及相关通路的影响

背景:白杨素是保健食品和中草药中常见的具有防癌抗癌活性的食源黄酮类天然产物。白杨素是否有助于防治肝癌?其作用机制为何?是否促进肝癌干细胞的分化?对此尚缺乏系统研究。目的:以人肝癌细胞为对象,揭示白杨素的亚细胞和分子作用机制。方法:应用酸性磷酸酶实验、扫描电镜、免疫印迹技术探讨白杨素对BEL-7402细胞的作用及其机制。结果与结论:白杨素显著抑制BEL-7402细胞的体外增殖,半数抑制浓度IC50为24.9mol/L或6.3mg/L。白杨素与PI3K-AKT途径特异性抑制剂LY294002联用具有显著的协同抗癌效应。但白杨素本身并不改变AKT、磷酸化pAKT、AKT下游分子GSK-3和磷酸化pGSK-3的表达水平,虽然高剂量下β-catenin略有下调。白杨素导致细胞表面微绒毛样突起密度明显增加并形成纳米膜粒;细胞回缩,间隙加宽;出现形态上不同于凋亡的死亡细胞。白杨素显著改变多种蛋白质的丝/苏氨酸磷酸化水平;对酪氨酸磷酸化亦有广谱下调作用,接近于表柔比星对照。白杨素对CDK1、磷酸化pCDK1和pCDK2、CDC25A、CDC25B和CD133均无明显影响,但可剂量依赖性诱导PARP-1降解。总之,白杨素对BEL-7402细胞的抑制作用并非起因于PI3K-AKT和Wnt/β-catenin通路阻断或细胞周期核心调控因子阻断,而更可能起因于生物膜功能障碍所致细胞表面超微结构和蛋白质磷酸化的大范围改变,并以非经典方式诱导肝癌细胞死亡。