周仲瑛治疗血液系统肿瘤经验

国医大师周仲瑛治疗血液系统肿瘤立足于病机辨证,把握＂痰瘀郁毒＂的核心病机,治疗以化痰祛瘀、散郁解毒为基本大法,疗效显著.     

吉西他滨化疗联合树突状细胞瘤内注射对小鼠巨大淋巴瘤的治疗作用

目的：观察吉西他滨对荷B细胞淋巴瘤小鼠脾脏中髓源抑制性细胞（myeloid derived suppressor cell, MDSC）的影响,以及吉西他滨化疗联合树突状细胞（dendritic cells, DCs）治疗巨大淋巴瘤的疗效。方法：小鼠皮下接种A20淋巴瘤细胞,30 d后形成巨大肿瘤,流式细胞仪分析吉西他滨化疗前后荷瘤小鼠脾脏中Gr1+CD11b+ MDSC的比例,免疫磁珠纯化的脾脏MDSC体外加入吉西他滨共培养后,AnnexinV/PI标记法检测细胞凋亡;观察荷瘤小鼠接受吉西他滨化疗联合DCs瘤内注射后肿瘤生长情况及小鼠存活期。结果：荷A20淋巴瘤小鼠脾脏中MDSC的比例显著上调,是正常小鼠脾脏中的10倍以上。体外吉西他滨时间依赖性诱导MDSC凋亡与坏死;荷瘤小鼠体内注射吉西他滨后,脾脏中绝大部分的MDSC被清除。单独吉西他滨注射或DCs瘤内注射对肿瘤生长产生一定的抑制作用,小鼠平均存活天数分别为（48.8±3.6）d和（47.2±7.4）d,而对照组小鼠平均存活天数为（38.8±2.2）d;吉西他滨化疗联合DCs瘤内注射后瘤体持续显著缩小,60%小鼠存活时间均超过90 d。结论：吉西他滨可有效清除荷瘤小鼠脾脏MDSC,吉西他滨化疗与DCs瘤内注射免疫治疗具有协同效应,可以提高对巨大淋巴瘤的疗效,本实验为应用生物化疗综合治疗模式治疗复发、难治性淋巴瘤提供了实验依据。     

急性髓系白血病FLT3基因突变研究

本研究探讨急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）患者中FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）基因内部串联重复突变（ITD）及第二酪氨酸激酶结构域（TKD）点突变及其临床意义。采用基因组DNA—PCR方法检测131例初发AML患者骨髓单个核细胞FLT3基因外显子14、15中ITD突变,采用基因组DNA—PCR结合限制性内切酶酶切方法检测FLT3基因外显子20中TKD点突变。结果表明：131例初治AML患者中,21例（16．0％）FLT3－ITD突变阳性,3例（2．3％）FLT3－TKD点突变阳性,无同一患者同时发生两种突变。FLT3－ITD阳性组初诊时白细胞计数（WBC）及骨髓原始细胞比例高于野生型FLT3（FLT3－wt）组。FLT3－ITD阳性组患者完全缓解（CR）率47．6％,显著低于FLT3－wt88．1％（P〈0．05）。20例M3患者中,FLT3－ITD阳性组及阴性组患者缓解率差异无统计学意义;非M3FLT3－ITD阳性组患者cR率为37．5（6／16例）,显著低于非M3FLT3－wt组患者CR率90．6％（48／53例）（P〈0．05）。阳性组患者完全缓解后14个月（2—20个月）内复发3例,复发率为50％（3／6）,高于FLT3－wt组29．2％（14／48例）。由于FLT3－TKD阳性患者仅3例,未单独进行统计学分析。结论：FLT3基因突变是AML患者中常见的突变,FLT3－ITD突变较FLT3－TKD点突变发生率高,FLT3－ITD有突变的AML患者预后差;FLT3－TKD点突变对预后的影响不明显。临床上早期FLT3基因突变检测对AML患者今后的靶向治疗及了解临床预后有重要意义。     

原发性骨髓增生异常综合征患者NPM1基因突变的研究

目的 探讨原发性骨髓增生异常综合征(MDS)患者NPM1基因突变情况及其与MDS患者临床特征的关系.方法 对232例原发性MDS患者采用基因组DNA聚合酶链反应(PCR)扩增NPM1基因第12外显子,直接测序检测突变状态,克隆后测序鉴定突变类型.比较NPM1突变患者与野生型患者的临床及实验室特征.结果 232例患者中NPM1突变9例(3.9%),均为A型突变.NPM1突变患者中性粒细胞绝对值(ANC)较低[突变型和野生型患者分别为0.60(0.12～2.91)×109/L和1.02(0～10.23)×109/L,P=0.046],骨髓原始细胞比例较高[突变型和野生型患者分别为0.050(0～0.090)和0.025(0～0.190),P=0.035],干/祖细胞培养后红系爆式集落(BFU-E)数量减低[突变型和野生型患者105个骨髓单个核细胞中集落数分别为0(0～0)和6(0～40),P=0.038],血清维生素(Vit)B12水平较高[突变型和野生型患者分别为936.40(373.80～2400.00)pmol/L和557.85(17.00～3032.10)pmol/L,P=0.045].NPM1突变患者以正常核型为主.结论 NPM1基因突变的MDS患者具有一些独特的临床和实验室特征,此为进一步研究NPM1基因突变与原发性MDS发生及转变为白血病的关系提供了重要线索.     

靶向CD19的CAR修饰的NK细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤

目的:利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,探讨以CD19 scFv序列构建CD19-CAR(pCD19-CAR)修饰的NK细胞对CD19+B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序法获得抗体的序列.分析抗体序列,并通过基因合成和分子克隆技术构建pCD19-CAR片段,然后将其克隆到慢病毒载体上,病毒包装制备后,转染NK-92MI细胞.最后,用流式细胞术检测不同的pCD9-CAR-NK-92MI细胞对CD19+细胞的杀伤率.结果:(1)成功筛出特异性强的CD19单克隆抗体-pCD19;(2)抗体检测结果显示CD19+的Ramos细胞的阳性率为84.3％,Raji为85.6％,与商业化抗体结果相似;(3)被pCD19-CAR修饰的CD19-CAR阳性率为28.72％的NK-92MI细胞对CD19+的Ramos和Raji细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的NK-92MI细胞株对Ramos和Raji细胞的杀伤率[(47.1±1.7)％vs(24.7±6.2)％和(51.8±7.9)％vs(27.6±9.6)％,均P＜0.05];对CD19-细胞Jurkat,不论是未被pCD19-CAR修饰的NK-92MI或是被修饰的NK-92MI细胞,几乎都不存在特异性杀伤作用[(16.1±0.7)％vs(17.7±2.9)％,P＞0.05].结论:成功构建pCD19-CAR,被pCD19-CAR修饰的NK-92MI细胞能特异性的识别CD19抗原并杀伤CD19+B细胞淋巴瘤细胞.     

靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体T细胞的构建及其对肿瘤细胞的杀伤

[摘要] 目的：探索通过嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）-T 细胞靶向B 细胞成熟抗原（B cell maturation antigen,BCMA）以治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）的方法。方法：构建基于鼠源BCMA scFv 的CAR-BCMA分子,包装为慢病毒载体并感染健康人T 细胞构建CAR-BCMA-T 细胞;构建BCMA阳性细胞系A549-BCMA、A549-BCMAOFP和K562-BCMA作为靶细胞。将CAR-BCMA-T细胞与构建的靶细胞和人骨髓瘤细胞U266 共孵育,CCK-8 法和流式细胞术检测其对BCMA阳性肿瘤细胞的杀伤能力。构建MM患者来源CAR-BCMA-T细胞并检测其杀伤靶细胞A549-BCMA的能力,并采用ELISA和流式细胞术检测CAR-BCMA-T细胞IFN-γ 的释放水平。结果：健康人来源的CAR-BCMA-T经过11 d 培养扩增300 倍,阳性率达到43%;成功构建BCMA阳性靶细胞。在5:1 效靶比下,CAR-BCMA-T对A549-BCMA、K562-BCMA和U266 细胞的杀伤率分别在80%、60%和80%左右,显著高于对BCMA阴性细胞的杀伤率,且杀伤力与靶细胞的BCMA表达强度相关。在效靶比20:1 时,MM患者来源CAR-BCMA-T细胞对靶细胞A549-BCMA的杀伤率达到95%以上,并且大量分泌IFN-γ。结论：本研究成功构建了健康人及MM患者来源的靶向BCMA的CAR-T细胞,其能够有效特异杀伤BCMA阳性的肿瘤细胞。     

IL-12-CAR-T细胞诱发细胞因子释放综合征小鼠模型的建立及观察

目的：通过构建表达IL-12的小鼠CAR-T细胞,探讨经尾静脉将其输注于小鼠体内建立细胞因子释放综合征（CRS模型的方法。方法：构建基于靶向鼠源CD19的CAR分子,包装逆转录病毒载体并感染小鼠T细胞构建mCD19-CAR-T、mCD19/IL-12-CAR-T细胞。通过构建小鼠体内胰腺癌Panc02-CD19细胞移植瘤模型,检测mCD19/IL-12-CAR-T细胞的抗肿瘤活性,ELISA法检测两种CAR-T细胞IL-12和IFN-γ分泌水平;经小鼠尾静脉输注mCD19/IL-12-CAR-T细胞构建CAR-T细胞CRS小鼠模型,流式细胞术检测小鼠血清中IL-6、MCP-1、IL-1、IL-10、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的含量,H-E染色法观察荷瘤小鼠肝、脾、肺和肾的病理组织学变化。结果：经过培养扩增的mCD19/IL-12-CAR-T细胞能有效分泌IL-12,CAR阳性率达（56.9±5.4）%;与非靶细胞Panc02或靶细胞Panc02-CD19共培养时,均能高分泌IFN-γ。成功构建小鼠胰腺癌Panc02-CD19细胞移植瘤模型,经小鼠尾静脉注射1×106个mCD19/...     

环孢菌素A对慢性再生障碍性贫血患者T-bet、GATA-3、相关信号分子、细胞因子及Th1/Th2的影响

本研究探讨转录因子T-bet、GATA-3及相关信号通路在慢性再生障碍性贫血(CAA)免疫发病中的作用,从Th细胞失衡、转录因子及相关信号通路水平研究环孢菌素(CsA)治疗慢性AA的免疫调节机理。采用实时荧光定量PCR(real-time FQ-PCR)检测慢性AA患者治疗前和CsA治疗6月后外周血单个核细胞(PBMNC)T-bet、GATA-3及STAT4、STAT6mRNA表达;采用流式细胞术、酶联免疫吸附法(ELISA)检测慢性AA患者治疗前和CsA治疗6月后外周血Th1、Th2比例及PBMNC培养上清IFN-γ、IL-12、IL-4水平,并与正常人进行比较。结果表明:慢性AA患者PBMNC T-bet、STAT4mRNA表达、T-bet/GATA-3比值、Th1比例、Th1/Th2比值、PBMNC培养上清IFN-γ、IL-12表达均明显高于正常组(p0.01),经CsA治疗6月后,患者T-bet、STAT4表达、T-bet/GATA-3比值、Th1比例、IFN-γ、IL-12表达均有所下降,但T-bet、STAT4、T-bet/GATA-3比值、Th1比例、IFN-γ表达仍未达到正常水平,GATA-3、STAT6mRNA表达、Th2比例、IL-4表达在治疗前后与正常人比较均无明显差异(p0.05)。结论:IFN-γ/T-bet、IL-12/STAT4通路的异常活化及Th平衡向Th1型偏移在AA免疫异常的发病过程中起到关键的作用;CsA能通过下调IFN-γ/T-bet、IL-12/STAT4通路的异常活化及纠正Th1过度极化而减轻AA异常亢进的细胞免疫,解除造血抑制。     

酪氨酸激酶突变与t（8；21）急性髓系白血病

本研究探讨c—KIT、FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）、Janus激酶2（JAK2）在伴t（8;21）的急性髓系白血病（AML）患者的突变情况,及其与患者临床表现和预后的相关性。采用普通PCR扩增技术、等位基因PCR技术、酶切及序列测定等方法,分别检测8例初发、6例复发t（8;21）AML患者FLT3、JAK2、c—KIT突变。结果表明：在2／14例（14．3％）伴t（8;21）的AML患者中检测到c—KIT突变,其中1例为c—KITD816V,另1例为c—KITD816Y突变;在1／14例（7．1％）患者中检测到FLT3-ITD突变。在14例标本中均未检测到JAK2突变。结论：酪氨酸激酶突变与t（8;21）AML具有相关性,可能提示有较高复发率及髓外浸润,预后不良。筛查c—KIT、FLT3突变等对t（8;21）AML预后判断和治疗指导可能具有重要意义。     

肿瘤患者经外周静脉置入中心静脉导管拔管困难原因分析及护理对策

<正>经外周静脉置入中心静脉导管(PICC)是经肘部贵要静脉、正中静脉或头静脉穿刺,导管尖端达上腔静脉的深静脉置管技术[1],主要用于需要多次进行静脉化疗的肿瘤患者。临床发现PICC拔管时出现了拔管困难,若强行拔管容易引起导管断裂体内、血管组织损伤等不良后果。我院2011年12月至2013年5月共拔除PICC导管767例,发生拔管困难12例,通过分析原因并提出相应的护理对策,均能成功将导管拔除,现报告如下。