荧光定量PCR检测c⁃Met CAR病毒感染T细胞的效率

目的：通过设计特异性引物,应用荧光定量PCR方法检测c?Met CAR病毒感染T细胞的效率。方法：应用基因重组技术构建c?Met CAR（GFP）逆转录病毒质粒。应用病毒包装技术制备c?Met CAR病毒与c?Met CAR（GFP）病毒,感染T细胞制备c?Met CAR?T细胞与c?Met CAR?T（GFP）细胞。Western blot检测c?Met CAR和c?Met CAR（GFP）在293T细胞中表达的外源性CD3ζ蛋白。设计特异性引物应用荧光定量PCR检测CAR病毒对T细胞的感染效率,并与流式细胞术的检测结果进行比较。结果：构建c?Met CAR（GFP）质粒,荧光显微镜可观察到c?Met CAR（GFP）质粒在293T细胞上表达绿色荧光蛋白。c?Met CAR和c?Met CAR（GFP）病毒感染的293T细胞可表达外源性CD3ζ蛋白。荧光定量PCR检测c?Met CAR与c?Met CAR（GFP）的感染效率分别为（52.1 ± 1.7）%、（55.9 ± 2.3）%。流式细胞术检测c?Met CAR（GFP）病毒感染效率为（50.7 ± 3.6）%,两种检测方法比较差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：通过设计特异性引物,应用荧光定量PCR方法能够特异性检测 CAR病毒对T细胞的感染效率,该检测方法结果准确、安全,对CAR?T细胞的临床应用具有实用价值。     

靶向Trop-2 CAR-T细胞的制备及其体外对卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的：制备靶向人滋养层细胞表面抗原2（human trophoblast cell surface antigen 2 , Trop-2)的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell , CAR-T）,观察Trop-2 CAR-T细胞在体外对卵巢癌细胞增殖的影响。方法：运用分子克隆及基因重组技术构建Trop-2 CAR;采用Western blot检测Trop-2 CAR在293T细胞中的表达;CCK-8法检测Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞增殖的影响;ELISA检测细胞因子分泌的变化。结果：酶切鉴定及测序分析结果表明,Trop-2 CAR各基因片段连接正确;Western blot检测结果显示,该质粒能够在293T细胞中有效表达;CCK-8结果显示,制备的Trop-2 CAR-T细胞在体外能明显抑制表达Trop-2的卵巢癌细胞的增殖（P＜0.05）;ELISA检测结果表明Trop-2 CAR-T细胞与表达Trop-2的卵巢癌细胞共培养后,干扰素（interferon-γ,IFN-γ)、白介素（interleukin-2,IL-2)细胞因子分泌增加（P＜0.01）。结论：该研究成功制备了Trop-2 CAR-T细胞,可有效抑制Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的增殖。     

Trop2对胃癌细胞耐药性的影响及机制研究

目的：探讨滋养层细胞表面抗原2（Trop2）对胃癌细胞化疗耐药的影响及机制。方法：应用慢病毒转染技术将Trop2 shRNA转染至BGC823细胞株,通过嘌呤霉素筛选出稳定转染质粒的细胞株;qRT?PCR、Western blot和免疫荧光方法检测质粒干扰效率;CCK?8细胞增殖试验和流式细胞术检测柔红霉素对BGC823细胞株增殖能力和细胞凋亡的影响;qRT?PCR、Western blot检测耐药相关基因TopoⅡα的mRNA和蛋白表达变化。结果：在稳定转染Trop2 shRNA质粒的shTrop2组中,Trop2 mRNA及蛋白表达水平较对照组（未处理）和shNC组（转染空载体质粒）明显下调;在相同药物浓度下,柔红霉素对shTrop2组的增殖抑制率明显高于对照组和shNC组,shTrop2组半数抑制浓度低于对照组和shNC组（P＜0.05）,shTrop2组中柔红霉素诱导的细胞凋亡率显著高于对照组和shNC组（P＜0.05）;稳定干扰Trop2表达后耐药相关基因TopoⅡα的表达显著上调。结论：Trop2通过抑制TopoⅡα的表达,可增强胃癌细胞对柔红霉素的耐药性。     

靶向c-Met嵌合抗原受体T细胞的制备及其对鼻咽癌细胞作用的研究

目的构建靶向c-Met的嵌合抗原受体(CAR)逆转录病毒载体,制备靶向c-Met CAR-T,观察其对c-Met阳性鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法利用基因工程技术构建抗c-Met scFv,并将其重组到含有CD28,CD137,CD3ζ等的逆转录病毒载体中,形成c-Met CAR逆转录病毒载体,测序确认。以该病毒载体感染T淋巴细胞,通过Western blotting检测c-Met CAR在T淋巴细胞中的表达。CCK-8检测c-Met CAR-T对鼻咽癌细胞的作用;通过ELISA检测c-Met CAR-T作用后IFN-γ、IL-2的变化。结果测序结果显示c-Met CAR病毒载体序列正确;Western blotting可检测到CD3ζ的表达;CCK-8结果显示,c-Met CAR-T明显抑制c-Met阳性的鼻咽癌细胞的增殖(P0.05);ELISA结果显示,c-Met CAR-T作用后分泌IFN-γ、IL-2明显增加(P0.01)。结论成功制备了靶向c-Met的嵌合抗原受体逆转录病毒载体。该嵌合抗原受体能在T细胞中表达,能有效抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞增殖,增加IFN-γ、IL-2的分泌。